開発した分析ツールを用いた包括的な糖鎖分析について研究を進めている。タンパク質(プロテイン)に続く第3の生命鎖と呼ばれている。多種多様な糖鎖(サブグライカン)は、タンパク質や脂質と結合して複合糖質を形成し、細胞表面を覆い生物学的な現象において重要な役割を果たしている。その糖鎖の機能を知る上で、糖鎖の構造解析は必要不可欠である。プロテオームは生物やシステムによって産生されたり修飾されたりするタンパク質の全体セットであり、プロテオミクスという用語はプロテオーム全体の大規模な研究を意味する。同様にグライコームは個々の生体が有する糖の総体を現し、グライコミクスはその全容解析である。糖鎖の多くは、糖タンパク質、スフィンゴ糖脂質、プロテオグリカン、GPIアンカーなどの複合糖質として存在している。それらの糖鎖の機能を解明するには、複合糖質の様々なクラスの糖鎖発現を測定する必要がある。一般的にはトランスジェニックマウスやノックアウトマウスを標的とした糖転移酵素に関連した糖鎖の解析に限られている。実際に異なるクラス間における糖鎖の関連解析などはほとんどなされていない。様々な糖転移酵素を標的としたトランスジェニックマウスやノックアウトマウスを解析しても明確な表現型の違いが認められないこともしばしば報告された1。これらの結果は、糖鎖の機能を解明するには包括的な複合糖質の糖鎖解析も必要であることを示唆している。以前に私たちはN型糖鎖、O型糖鎖、グリコサミノグリカン(GAG)、スフィンゴ糖脂質糖鎖(GSL糖鎖)そして遊離オリゴ糖(fOS)を質量分析計やHPLCで解析するための調製および分析の一連の方法論を報告してきた2,3,4,5。これらの異なるクラスの複合糖質糖鎖の解析法を統合し、細胞や血清中に存在するサブグライカンの全体像を俯瞰できるようになった(総合グライコミクス)6,7。現在も糖鎖解析のための新しい技術開発や改良を続けており、シアリル化糖鎖異性体を質量分析法で識別する技術、シアル酸結合様特異的アルキル化法(SALSA)を構築してきた8。ヒューマングライコームプロジェクト(HGA)のセグメント2では、大規模な糖鎖カタログ(ヒト血漿総合グライコーム)を作成して、TOHSAと呼ばれる大規模データベースの構築することが最も重要なミッションの一つである。大規模コホート解析を目的としたヒト血漿/血清中に含まれるN型糖鎖の全自動前処理装置の開発など、最近の私たちの研究ついて紹介する。型糖鎖付加はタンパク質の翻訳後修飾の一つであり、N型糖鎖はアスパラギン(Asn)残基の側鎖に結合している。N型糖鎖は、特徴的な構造に応じてパウチマンノース型、オリゴマンノース型、ハイブリッド型そして複合型の4つのタイプに大きく分類される。ヒト血清中では、分泌蛋白質の50%以上が糖鎖修飾を受けていると言われている。F)によってタンパク質から容易に切り出すことできる。FによるN結合型糖鎖の切断効率を高めることができる9。このように調製された試料には,アルキル化試薬やトリプシン消化ペプチドなどの多くの夾雑物を含むため,糖鎖を解析するには糖鎖の精製工程が必要になる。私たちはケミカルライゲーションを介したグライコブロッティング法によって切断した糖鎖の精製を行なっている2。切断された糖鎖は還元末端にヘミアセタール(アルデヒド)基を持っており、このような官能基を有する化合物は血清中にはほとんど存在しない。グライコブロッティング法により糖鎖を選択的に捕捉・精製することが可能になる。MS測定によるシアリル化糖鎖の定量は困難である10。グライコブロッティング法では固相上でシアリル化の誘導化も可能である。この修飾の詳細については次の章で紹介する。最終的にN結合型糖鎖はBlotGlycoビーズより切り離され、同時に質量分析に適した標識化が行われる。グライコブロッティング法の詳細な実験法について以前の報告を参照されたい。シグナル伝達に関与している11。シアル酸のα-グリコシド結合は不安定であり、結果として質量分析による測定過程で糖鎖の末端のシアル酸の脱離が起こる。それに加えて異なる結合様式を持つ構造異性体は同じ分子量を持つため質量分析による識別ができない。最近の研究では、糖鎖異性体を質量分析で区別するためにいくつかのユニークなシアル酸の結合様式特異的な誘導化が報告されている。私たちも結合様式特異的な誘導化法を開発してきた。私たちの方法ではグライコブロッティング法によりシアル酸を含むN結合型糖鎖を固相上に捕捉する。固相上で最初の縮合反応を行うことができ、α2,6結合のシアル酸のカルボキシル基はイソプロピルアミドへ、それに対してα2,3とα2,8結合のシアル酸からは分子内ラクトンが形成される。私たちはこの分子内ラクトンを経由したα2,3とα2,8結合のシアル酸の結合様式特異的アミド化を開発した。wellフィルタープレートにアミン溶液を単に加えるだけである。その結果ラクトン環が開裂するのと同時にアミド化(アミノリシス)が引き起こされる。これによりSALSA法の反応時間は2時間から1時間へと短縮できた。