03.04.2020今回も、前々回と前回に引き続き、(共)免疫沈降法に関する基本情報やポイントについてご紹介します。前回もご説明しましたが、(共)免疫沈降法は比較的シンプルな手法ですが、それでも下の表に示すような複数のファクターが関係しています。実験を成功させるためにも各ファクターについて理解し、マテリアルの選択、抗体固定化やバッファーの調製を、それぞれ目的に合わせて行うことが望まれます。以下では、それぞれのファクターについて個別にご紹介します(今回は『結合バッファー』、『洗浄バッファー』、『溶出バッファー』の各種バッファーについて説明します。『実験フォーマット』〜『ライセートの前処理』については前々回、『抗体の固定化』については前回をご覧ください。免疫沈降における結合バッファーの条件として、抗原と抗体とのアフィニティー相互作用を阻害しないことが求められます。共免疫沈降の場合は、IP抗体と反応する抗原(baitタンパク質)が相互作用する別のタンパク質(preyタンパク質)との反応を阻害しない条件が必要になります。通常、抗原と抗体のアフィニティーは高いため、中性付近の一般的なバッファー(PBSやTBS)が使用できます。baitとprey間のアフィニティーはタンパク質によって大きく異なるため、pHや塩濃度の至適条件を検討する必要があります。相互作用に補因子が必要な場合は結合バッファーに補因子を添加する必要があります。界面活性剤や還元剤の存在により反応が阻害される場合にはそれらの除去も必要になります。洗浄バッファーは、抗原抗体反応やタンパク質間相互作用を維持しつつ、非特異的に結合しているタンパク質を除去できるバッファーが理想的です。CHAPS)を添加します。免疫沈降における溶出では、ウェスタンブロッティングによる検出を前提として、SDSサンプルバッファーを利用することも可能です。SDSサンプルバッファーを利用すると、変性と還元作用により効率よくタンパク質を回収できます。変性作用が大きいためIP抗体の再利用ができない点や下流の実験における回収タンパク質の利用方法に制限が生じる点がデメリットです。pH2.5-3のような酸性のバッファーです。原抗体反応もあります)。8.5など)と混合することによりタンパク質への影響を抑えることができます。この条件でも短時間酸性条件にさらされることで溶出タンパク質がダメージを受けることもあります。変性作用の最も少ない溶出バッファーとして、塩濃度の高いバッファーも利用できます。Bufferをご用意しています。pH2.5-3より落ちることがあります。その他、さまざまな溶出バッファーが知られています(表2)。反応系や下流の実験に合わせてご検討ください。リン酸バッファー(特にリン酸カリウムを含むバッファー)と混合すると不溶性の沈殿が生じてしまいます。8.0のご使用をおすすめします。【無料ダウンロード】タンパク質解析ワークフローハンドブック効率的なタンパク質抽出からウェスタンブロッティングの解析ツールまで、包括的にソリューションを紹介しております。PDFファイルのダウンロードをご希望の方は、下記ボタンよりお申込みください。ダウンロード研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用はできません。(必須)*サーモフィッシャーサイエンティフィックジャパングループ各社は取得した個人情報を弊社の個人情報保護方針に従い利用し、安全かつ適切に管理します。取得した個人情報は、グループ各社が実施するセミナーに関するご連絡、および製品/サービス情報等のご案内のために利用させていただき、その他の目的では利用しません。詳細は個人情報の取扱いについてをご確認ください。最新製品情報やお得な情報のメール配信・DM送付をご希望されますか?(必須)*希望する、または既に受け取っている希望しない送信の際には、このページに記載のすべての注意事項に同意いただいたものとみなされます。