単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の技術と方法論的進歩は、生物学的高分子の高解像度構造決定のための新しい道を開きました。クライオEMの著しい進歩にもかかわらず、単粒子分析ワークフローの様々な側面において改善の余地が依然として存在する。単粒子分析では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージが必要です。過去8年間に単粒子クライオEM用の自動イメージング用に、いくつかの自動データ取得ソフトウェアパッケージが開発されました。本論文は、低用量条件下でのガラス化生体分子に対する完全自動画像取得パイプラインの適用を提示する。これは、cryo-EMデータを完全、自動的、および正確に収集できるソフトウェアパッケージを示しています。さまざまな顕微鏡パラメータは、このソフトウェアパッケージによって容易に制御されます。-コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイクタンパク質の自動イメージングにおけるこのソフトウェアパッケージの可能性を示しています。1回のセッション(48時間)で約3,000枚のクライオEMムービー画像を取得し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の原子分解能構造を生み出しました。この構造研究は、スパイクタンパク質が開いた1-RBD(受容体結合ドメイン)およびすべてのRBD閉鎖された立体構造の2つの主要な立体構造を採用することを示している。Introduction単粒子クライオEMは、生体高分子の高分解能構造決定のための主流の構造生物学技術となっています1。3次元(3D)構造を再構築するために使用されます。DEDの開発前に、単粒子の再構成から達成された分解能は4から30Å4,5の範囲に及んだ。DEDおよび自動データ収集ソフトウェアは、データ収集のための人間の介入が最小限に抑えられるこの解決革命7の主要な貢献者となっています。e/Å2)で行われ、生体試料の電子ビームによる放射線損傷を最小限に抑え、画像内の低信号対雑音比(SNR)に寄与します。この低いSNRは、単粒子分析を用いた生体高分子の高分解能構造の特性解析を妨げる。新世代の電子検出器は、CMOS(相補的な金属酸化物半導体)ベースの検出器で、これらの低いSNR関連の障害を克服することができます。これらの直接検出CMOSカメラは、カメラが優れた点広がり機能、適切なSNR、および生体高分子のための優れた探偵量子効率(DQE)に寄与するため、信号の高速読み出しを可能にします。検出カメラは、記録された画像に高いSNR8と低ノイズを提供し、その結果、検出器が画像にどれだけのノイズを追加するかを測定する探偵量子効率(DQE)の定量的な増加をもたらします。9,10.これらの特性はすべて、低線量のアプリケーションに適した高速直接検出カメラを作ります。動補正スタック画像は、RELION11、FREALIGN12、cryoSPARC13、cisTEM14、EMAN215などの様々なソフトウェアパッケージを使用して、2D分類を計算し、高分子の3D密度マップを再構築するためにデータ処理に使用されます。単一粒子解析では、高解像度の構造を実現するためには膨大なデータセットが必要です。したがって、自動データ取得の通行料は、データ収集に非常に重要です。大規模なクライオEMデータセットを記録するために、過去10年間にいくつかのソフトウェアパッケージが使用されてきました。AutoEM16、AutoEMation17、Leginon18、SerialEM19、UCSF-Image420、TOM221、SAM22、JAMES23、JADAS24、EM-TOOLS、EPUなどの専用ソフトウェアパッケージが自動データ取得用に開発されています。これらのソフトウェアパッケージは、低倍率画像を高倍率画像に相関させることによって、自動的に穴位置を見つけるためにルーチンタスクを使用し、低線量条件下で画像取得のための割り当て氷の硝子体氷で穴を識別するのに役立ちます。これらのソフトウェアパッケージは、繰り返しのタスクの数を減らし、オペレータの物理的な存在を中断することなく、数日間連続して高品質のデータの膨大な量を取得することにより、クライオEMデータ収集のスループットを向上させます。DEDsにのみ適しており、これらの検出器を備えています。このデータ収集ツールを使用して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の3,000のムービーファイルが自動的に取得され、さらにデータ処理が行われ、3.9-4.4Å分解能スパイクタンパク質構造を得ます。Protocol注:クライオEMデータ収集には、1.cryo-EMグリッドの準備、2.顕微鏡のキャリブレーションとアライメント、3.自動データ収集の3つの重要なステップが必要です(図1)。自動データ収集は、適切な領域選択、b.の最適化、緯度-S、c.開始自動穴選択、およびd.開始自動データ収集に細分化されます(図1)。Results現在のパンデミック状況では、CRYO-EMはSARS-CoV-226-226,27,28,29の様々なタンパク質の構造を特徴づける上で重要な役割を果たしており、ウイルスに対するワクチンや薬剤の開発に役立つ可能性があります。2019年のコロナウイルス病に対抗するために、限られた人材を持つ迅速な研究努力が急務です。ファイルを自動的にセットアップして収集する環境を提供します。それは格子を渡る容易な運行を提供し、顕微鏡段階の位置を維持し、低倍率から高倍率に移動する。disclose.Acknowledgements我々は、バイオテクノロジー省、科学技術省(DST)、インドの人事開発省(MHRD)に対し、IISc-バンガロールの資金調達とクライオEM施設について認める。我々は、バンガロール州IIScのナショナルクライオEM施設に対するDBT-BUILDERプログラム(BT/INF/22/SP22844/2017)とDST-FIST(SR/FST/LSII-039/2015)を認めます。(SERB)(グラントNo.SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608およびSERB-IPA/2020/000094)、DBT(グラントNo.1)からの財政支援を認める。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)。材料表の準備をしてくれたイシカ・プラマニックさんに感謝します。スマン・ミシュラ氏のクライオEM画像処理と、フィギュアの準備を手伝ってくれたことに感謝します。ラガヴァン・バラダラジャン教授は、この研究のために精製スパイクタンパク質サンプルを入手するのを助けてくれたことに感謝します。reserved×-1::1。