(C)巻号頁・発行日1995リンゴを切ると褐変することはよく知られた現象で、酵素的褐変の典型例である。これは、リンゴ細胞中のポリフェノール類がポリフェノールオキシダーゼ(PPO)により酸化されキノン体となり、それがさらに重合するためと考えられている。リンゴPPOは、我々により1992年に初めて単離された。抗PPO抗体を調整し、PPOのリンゴ組織内分布を検討したところ、PPOはリンゴ果実の中心付近(種子の回り)に局在することがわかり、これが褐変部位と一致した。このようにリンゴPPOは、リンゴの褐変に中心的役割をはたすが、構造と活性の詳細は未詳であり、また、その発現を制御することにより褐変をコントロールすることも試みられていない。そこで申請者は、まずリンゴPPO遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにすることとした。リンゴPPOをコードすると予想されるプライマーを用い、PCR法によりゲノムDNAを増輻した。その結果、PPO遺伝子と思われるバンドが検出された。増輻断片をpBluescriptに組み込み、大腸菌に導入した。得られた十数個のコロニーの遺伝子を調べたところ2個のPPO遺伝子を得ることができた。各々をシークエンスし、全塩基配列を決定し、アミノ酸配列に翻訳した。その結果、リンゴPPO遺伝子にはイントロンがないこと、シグナルシークエンスよりPPOタンパク質はプラスチドへ輸送されること、銅2分子が結合すると予想される保存性の高い2つの活性中心領域(Cu-A、Cu-B)が存在すること等が明らかとなった。本遺伝子の大腸菌中での発現に成功した。発現タンパク質はPPO活性を有し、かつ抗リンゴPPO抗体と反応した。あるメラノイジンの性質と主な前駆物質を食品ごとに明らかにした。ラットにおける出納試験を調べた。食品メラノイジンの特徴解析に有効であることをみとめた。金属キレートアフィニティーを併用した。凍り豆腐の褐変は多価不飽和脂肪酸の酸化で生じたカルボニル化合物がタンパク質と反応して生じるエーテル可溶性の褐色色素であった。コーヒーの褐変はショ糖とアミノ酸・タンパク質とのメイラード反応にクロロゲン酸などのフェノール系酸化重合物を多量に巻き込んだ高分子である。(B)巻号頁・発行日2000コーヒーの試料として大量に入手でき、保存ができるインスタントコーヒーを選び、コーヒー亜鉛複合体を以下のとおり調製した。KClを含む)にコーヒーを溶かし、終末濃度20mMになるようZnCl_2を加え、生じた沈殿を集めた。IR120にかけ、水と1%アンモニアで溶出し、Zn含量の高い画分を塩酸で酸性にして生じた沈殿を遠心分離した。kd=8.6×10^<-9>)画分(Ap-V)であった。分子サイズは48kDで構成成分は30.4%のフェノール、糖とアミノ酸がそれぞれ3%と4%、ケルダール法による窒素含量が10%を越えた。リンが殆ど検出されなかったのでZn-キレート性成分の形成にメイラード反応とフェノール化合物の酸化分解や重合の関与を推定した。高分子のAp-V画分の構成成分を推定するために、アルカリ溶融分解を行い中性と酸性画分に主要な分解物が回収されてくることを確かめた。3D-HPLCとLC-MSによる解析の可能性を見いだした。キレート成分の生成する要因を調べるためコーヒー生豆の熱水抽出液乾燥粉からインスタントコーヒーと同様にキレート成分を精製した。Ap-V全量中の亜鉛含量は生豆よりインスタントコーヒーの方が多かったが、1g当りの亜鉛含量は生豆の方が多く、生豆は多くのZnをキレートすることが示唆された。インスタントコーヒーのAp-Vは、470nm吸光度が高い値を示し、生成に焙煎が関与している可能性が高い。生豆のAp-Vでは280nmの吸収も確認され、また生豆試料をトリプシン処理したもののキレート能を比べるとAp-V全量中の亜鉛含量が極端に減少したことから、生豆の亜鉛キレート性成分は約13,000Dと約10,300Dのタンパク質である可能性が示唆された。コーヒーを飲む時、乳脂肪やタンパク質の多いクリームを加えて飲むことが多い習慣をふまえ、熱いコーヒーにミルクを添加したサンプルからAp画分を調製したところ、コーヒーのみから調製したAp画分より亜鉛含量が低かった。そのため、乳成分はコーヒー成分と複合体をつくることにより、コーヒーのキレート作用を抑制することがあると考えられる。30340の3株を用い、褐色色素の脱色率を調べた。14はXylとGly、またGlcとLysより調整したメラノイジンをよく脱色した。フェノールの重合色素は脱色せず、逆に着色した。30340はすべてのモデルメラノイジンをよく脱色したが、フェノール系の色素は脱色せず、着色した。NC-1はXylとGly、GlcとTrpから調整したメラノイジンを50%以上脱色し、またフェノール系の色素も脱色した。カラメルA、黒ビール、麦茶、ウスターソースA,B,C、ココア、チョコレートなど、アミノカルボニル反応が主体と考えられる食品を50%以上脱色した。NC-1は、インスタントコーヒー、紅茶、ウスターソースC、ココア、チョコレートなど、フェノールの重合反応が関わっていると考えられる食品も50%以上脱色した。これはモデル褐色色素の脱色の結果とよく一致している。このことより、カラメルAはGlyやLysが着色促進剤として加えられ、Xyl-Gly、Glc-Lysメラノイジンのような反応が起こっているのではないか、またコーラにはカラメルAのようなカラメルが添加されているのではないか、ウスターソースCはウスターソースAやBよりもフェノールの関与が強そうであるなど、これらの微生物を用いることにより、食品の褐色色素の識別が可能であることが示唆された。