Ligação e hidrólise da meperidina pela carboxilesterase hepática humana hCE-1.
(17/1703) As carboxilesterases hepáticas humanas catalisam a hidrólise de drogas apolares ou ésteres xenobióticos em produtos ácidos e alcoólicos mais solúveis para eliminação. Duas carboxilesterases, hCE-1 e hCE-2, foram purificadas e caracterizadas quanto ao seu papel na hidrólise da cocaína e da heroína. A ligação de meperidina (Demerol) e propoxifeno (Darvon) foi examinada em um ensaio espectrofotométrico de ligação competitiva. O hCE-1 e o hCE-2 ligaram-se a ambos os fármacos, com valores de Ki na faixa de 0,4 a 1,3 mM. A meperidina foi hidrolisada em ácido meperidínico e etanol por hCE-1, mas não por hCE-2. O Km da hCE-1 para a meperidina foi de 1,9 mM e o kcat (constante de velocidade catalítica) foi de 0,67 min-1. A hidrólise da meperidina por hCE-1 foi consistente com a sua especificidade para hidrólise de ésteres contendo substituintes simples de álcool alifático. Assim, a hCE-1 nos microssomas hepáticos humanos pode desempenhar um papel importante na eliminação da meperidina. O propoxifeno não foi hidrolisado por hCE-1 ou hCE-2. Esta observação é consistente com a ausência de uma via hidrolítica importante para o metabolismo do propoxifeno em humanos. (+informações)
Um quadro de leitura aberta alternativo não definido por AUG do mRNA da carboxil esterase intestinal gera um epítopo reconhecido por linfócitos infiltrantes de tumor reativos ao carcinoma de células renais in situ.
(18/1703) Vários Ags reconhecidos por células T reativas a tumores foram caracterizados, incluindo produtos gênicos não mutados e uma variedade de epítopos que demonstraram surgir de transcritos mutados ou alternativamente processados. Aqui, relatamos que a triagem de uma biblioteca de cDNA com um clone de células T reativas a carcinoma de células renais restrito a HLA-B7 derivado de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) que foram amplificados clonalmente in vivo (conforme avaliado pela região determinante de complementaridade de TCRBV- 3) resultou no isolamento de um nonamer codificado por um quadro de leitura aberto alternativo (ORF) (um frameshift +1) do gene da carboxil esterase intestinal. Este peptídeo liga moléculas apresentadoras de HLA-B*0702 conforme avaliado em um ensaio de ligação de peptídeo baseado em imunofluorescência usando células T2 transfectadas. A expressão constitutiva desta proteína ORF alternativa foi observada em todas as linhas celulares renais HLA-B7+ transformadas que foram reconhecidas em ensaios de citotoxicidade pelos TILs. O gene da carboxil esterase intestinal é transcrito em tumores de carcinoma de células renais, bem como em tecidos normais do fígado, intestinos ou renais. A mutação do local natural de iniciação da tradução do ATG não alterou o reconhecimento, indicando que a mudança de quadro (ou seja, o deslizamento do ribossomo para frente) e a recodificação não estão envolvidas. Além disso, uma mutação pontual dos três códons AUG que podem ser usados ​​como locais alternativos de iniciação da tradução na ORF +1 não aboliu o reconhecimento, enquanto a mutação de um códon ACG a montante o fez, indicando que o último códon inicia a tradução do códon alternativo ORF. Estes resultados ampliam ainda mais os tipos de Ags que podem ser reconhecidos por TILs reativos a tumores in situ (isto é, levando à expansão clonal de células T). (+informações)
Consequências da quebra da ligação de hidrogênio Asp-His da tríade catalítica: efeitos na estrutura e dinâmica da serina esterase cutinase.
(19/1703)O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos na estrutura e na dinâmica que ocorrem com a quebra da ligação de hidrogênio Asp-His na tríade catalítica Asp175-His188-Ser120 da serina esterase cutinase no Estado Fundamental. Quatro simulações de dinâmica molecular foram realizadas nesta enzima em solução. As estruturas iniciais em duas simulações tinham a ligação de hidrogênio Asp175-His188 intacta, e em duas simulações a ligação de hidrogênio Asp175-His188 foi quebrada. As conformações dos resíduos que compõem a tríade catalítica são bem comportadas durante ambas as simulações contendo a ligação de hidrogênio Asp175-His188 intacta. Contatos curtos inferiores a 2,6 A foram observados em 1,2% das distâncias amostradas entre os oxigênios carboxilato do Asp175 e o NE2 do His188. As simulações mostraram que os resíduos do sítio ativo apresentam grande mobilidade quando a ligação de hidrogênio Asp175-His188 é quebrada. Nas duas simulações em que a ligação de hidrogênio Asp175-His188 não está presente, as geometrias finais dos resíduos da tríade catalítica não estão em conformações cataliticamente produtivas. Em ambas as simulações, Asp175 e His188 estão separados por mais de 6 A na estrutura final da dinâmica, e as cadeias laterais de Ser120 e Asp175 estão mais próximas do NE2 de His188 do que de ND1. Foram observados efeitos não locais na estrutura da cutinase. Uma alça formada pelos resíduos 26-31, que está na extremidade oposta da proteína em relação ao sítio ativo, foi grandemente afetada. Outras mudanças na dinâmica da cutinase foram determinadas a partir da análise do modo quase-harmônico. A frequência do segundo modo mais baixo foi bastante reduzida quando a ligação de hidrogênio Asp175-His188 foi quebrada, e vários modos mais elevados mostraram frequências mais baixas. Todas as quatro simulações mostraram que o buraco oxiânion, composto pelos resíduos Ser42 e Gln121, é estável. Apenas uma das ligações de hidrogênio (Ser42 OG a Gln121 NE2) observada na estrutura cristalina que estabiliza a conformação de Ser42 OG persistiu ao longo das simulações. Esta ligação de hidrogênio parece ser suficiente para que o buraco do oxiânion retenha sua integridade estrutural. (+informações)
A acil-CoA tioesterase microssomal de cadeia longa (carboxilesterase ES-4) é regulada pela tiroxina.
(20/1703) A atividade da acil-CoA tioesterase de cadeia longa está localizada principalmente em microssomas após fracionamento subcelular do fígado de ratos não tratados. A função fisiológica e a regulação da expressão desta atividade não são conhecidas. No presente estudo, investigamos o efeito da tiroxina na expressão da carboxilesterase ES-4, a principal acil-CoA tioesterase dos microssomas hepáticos. A tireoidectomia de ratos diminuiu a atividade da palmitoil-CoA tioesterase para cerca de 25% da atividade normal. Esta diminuição foi acompanhada por diminuições semelhantes nos níveis de proteína e mRNA (31% e 57%, respectivamente, dos controlos). O tratamento com tiroxina reverteu completamente o efeito da tireoidectomia e resultou em níveis elevados tanto em ratos tireoidectomizados quanto em ratos controle. Por razões de comparação, também estudamos a possibilidade de ES-10 e ES-2, dois outros membros da mesma família de genes, serem afetados pela tiroxina. ES-10 não foi alterado no nível de proteína ou mRNA por nenhum dos tratamentos, enquanto a expressão de ES-2 no fígado foi diminuída pelo tratamento com tiroxina. Os dados mostram que as alterações na actividade e expressão de ES-4 se correlacionam com o estado de tiroxina no rato, sugerindo um papel regulador fisiológico desta hormona. Uma vez que a tiroxina regula a expressão de enzimas lipogénicas, estes resultados são consistentes com uma função desta acil-CoA tioesterase microssomal na síntese e/ou secreção de ácidos gordos, e não na degradação oxidativa de ácidos gordos. (+informações)
CPT-11 convertendo atividades de carboxilesterase e topoisomerase em tecidos tumorais e normais de cólon e fígado.
(21/1703)CPT-11 é um pró-fármaco ativado por carboxilesterases no metabólito ativo SN-38, que é um potente inibidor da topoisomerase I. O CPT-11 é de interesse clínico no tratamento do câncer colorretal. Avaliamos as atividades da carboxilesterase conversora de CPT-11 (CPT-CE) e da topoisomerase I (topo I) em 53 tumores colorretais, em oito metástases hepáticas e em tecido normal adjacente aos tumores. As atividades de CPT-CE e topo I foram amplamente variáveis ​​​​no tecido maligno e normal de pacientes com carcinomas colorretais. O CPT-CE foi apenas duas a três vezes menor nos tumores primários em comparação com o fígado normal, sugerindo que uma conversão local para SN-38 pode ocorrer nas células tumorais. O CPT-CE foi semelhante no fígado e nos tecidos normais do cólon. Os níveis de topo I no tumor variaram de 580 a 84.900 U mg de proteína (-1) e estavam acima de 40.000 U mg de proteína (-1) em 11 dos 53 pacientes. Da mesma forma, uma proporção muito elevada (> 5) entre tumor e tecidos normais foi observada em 12 dos 53 pacientes. Foi observada uma correlação inversa entre a atividade do topo I e o estágio clínico da doença. Estudos clínicos estão em andamento em nossa instituição para explorar uma possível relação entre as atividades de CPT-CE e topo I em células tumorais e a resposta à quimioterapia baseada em CPT-11 em pacientes com câncer colorretal. (+informações)
Os polimorfismos da paraoxonase não estão associados a risco cardiovascular em receptores de transplante renal.
(22/1703) FUNDAMENTO: Variantes do gene da paraoxonase (PON1) foram identificadas como fatores de risco para doenças cardiovasculares (DCV). Existem dois polimorfismos PON1 comuns na posição 55 (alteração Leu-Met) e 192 (alteração Gln-Arg) da cadeia de aminoácidos. A leucina na posição 55 e a arginina na posição 192 foram associadas ao aumento do risco cardiovascular. O aumento da prevalência de DCV em receptores de transplante renal só pode ser parcialmente explicado pelo aumento da prevalência de fatores de risco convencionais. MÉTODOS: Portanto, investigamos polimorfismos da PON1 em receptores de transplante renal (N = 491) com (N = 103) e sem DCV (N = 388) usando análise do comprimento do fragmento de restrição por reação em cadeia da polimerase. Os polimorfismos da PON1 e suas atividades associadas da PON1/arilesterase também foram avaliados em um subgrupo de pacientes (N = 165). RESULTADOS: A distribuição genotípica e as frequências alélicas para ambos os polimorfismos foram semelhantes nos dois grupos. As frequências dos genótipos LL, LM e MM para a posição 55 em pacientes com DCV foram 0,39, 0,51 e 0,10, respectivamente, em comparação com 0,43, 0,43 e 0,14 em pacientes sem DCV (P = 0,31). A distribuição dos genótipos QQ, QR e RR na posição 192 foi de 0,48, 0,43 e 0,09, respectivamente, em pacientes com DCV, em comparação com 0,46, 0,46 e 0,08 em pacientes sem DCV (P = 0,8). Houve diferenças altamente significativas nas atividades séricas da PON1/arilesterase entre os genótipos definidos pelos polimorfismos 55 e 192. A leucina na posição 55 e a arginina na posição 192 foram associadas a atividades mais elevadas. CONCLUSÃO: Esses dados indicam que não há associação entre as variantes do gene PON1, que conferem maior atividade enzimática, e o aumento do risco cardiovascular em receptores de transplante renal. (+informações)
A fotorredução da ligação dissulfeto mediada por triptofano causa um comportamento incomum de fluorescência da cutinase de Fusarium solani pisi.
(23/1703) O sinal de fluorescência do único resíduo de triptofano (Trp69) da cutinase de Fusarium solani pisi é altamente extinto. No entanto, a irradiação prolongada da enzima na banda de absorção do triptofano causa um aumento no rendimento quântico da fluorescência do triptofano em uma ordem de grandeza. Usando uma combinação de espectroscopia de RMN e detecção química de grupos tiol livres com um reagente sulfidrila, pudemos mostrar inequivocamente que o comportamento incomum de fluorescência de Trp69 na cutinase é causado pela quebra da ligação dissulfeto entre Cys31 e Cys109 após irradiação, enquanto a amida -a ligação de hidrogênio aromática entre Ala32 e Trp69 permanece intacta. Este é o primeiro exemplo de fotorredução mediada por triptofano de uma ligação dissulfeto em proteínas. (+informações)
O agrupamento do complexo quimiorreceptor em Escherichia coli é independente da metiltransferase CheR e da metilesterase CheB.
(24/1703) Os quimiorreceptores de Escherichia coli e suas proteínas citoplasmáticas associadas, CheA e CheW, agrupam-se predominantemente nos pólos celulares. A natureza do agrupamento permanece um mistério. Estudos recentes sugerem que a ligação e/ou metilação do CheR aos quimiorreceptores pode desempenhar um papel na agregação do complexo quimiorreceptor. Neste estudo, examinamos a distribuição intracelular dos quimiorreceptores por microscopia imunoeletrônica em cepas sem a metiltransferase CheR ou a metilesterase CheB. Os dados de localização revelaram que, in vivo, a agregação do complexo quimiorreceptor era independente de CheR ou CheB. (+informações)