根據亞歷山大·弗萊明爵士發現青黴素的實驗段落，告訴我青黴素對哪些細菌具有抗菌作用，並列出發現青黴素所必需的條件。
1927年，弗萊明開始研究葡萄球菌的特性。他早在此前就因為他的工作而出名，並且已經成為了一位傑出的研究者。1928年，他研究了在自然條件下生長的金黃色葡萄球菌的變異，這是在約瑟夫·沃裡克·比格的工作之後，後者發現這種細菌可以生長成多種型別（菌株）。1928年9月3日，弗萊明和家人在薩福克度假後回到了他的實驗室。在離開度假之前，他在培養皿上接種了葡萄球菌，並將它們放在實驗室角落的一個檯子上。回來後，弗萊明發現一個培養皿被真菌汙染了，而真菌周圍的葡萄球菌菌落被摧毀了，而其他遠離真菌的葡萄球菌菌落則正常，他著名地說：「這很有趣。」弗萊明將被汙染的培養皿展示給了他的前助手梅林·普賴斯，後者提醒他：「這就是你發現溶菌酶的方式。」他將這種黴菌鑑定為青黴屬。他懷疑它是金黃色青黴（P. chrysogenum），但同事查爾斯·J·拉圖奇（Charles J. La Touche）將其鑑定為紅黴（P. rubrum）。 （後來更正為P. notatum，然後正式接受為P. chrysogenum；在2011年，它被確定為P. rubens。）
弗萊明發現和測試青黴素的實驗室被保留為亞歷山大·弗萊明實驗室博物館，位於帕丁頓聖瑪麗醫院。真菌汙染物的來源在1966年被確定為來自拉圖奇的房間，該房間直接在弗萊明的下面。
弗萊明在純培養物中培養了這種黴菌，並發現培養液中含有一種抗菌物質。他研究了它對許多生物的抗菌作用，並注意到它影響了像葡萄球菌和許多其他革蘭氏陽性病原體一樣的細菌，這些細菌會引起猩紅熱、肺炎、腦膜炎和白喉，但不影響由革蘭氏陰性細菌引起的傷寒或副傷寒，而當時他正在尋找治療這些疾病的方法。它也影響了淋病菌，這種細菌是革蘭氏陰性的。在稱它為「黴菌汁」或「抑制劑」幾個月後，他於1929年3月7日將其命名為黴菌中存在的抗菌物質——青黴素。
青黴素對多種革蘭氏陽性菌具有抗菌作用，包括但不限於引起腦膜炎、白喉、肺炎、猩紅熱的細菌。它還作用於引起皮膚和軟組織感染（例如癤子）的（革蘭氏陽性）葡萄球菌。青黴素還被發現對引起淋病的革蘭氏陰性菌具有抗菌作用。一系列偶然的情況共同促成了青黴素的發現，其中之一是亞歷山大爵士在離開前將葡萄球菌留在實驗室的培養物中後，選擇與家人一起度假。有趣的是，亞歷山大爵士對實驗室衛生有點馬虎，這促成了他之前發現溶菌酶，似乎同樣缺乏護理也是青黴素的發現的部分原因。最後，他的實驗室和培養物的具體位置也發揮了作用——對葡萄球菌培養物具有抗菌作用的真菌汙染物來自亞歷山大爵士的同事實驗室下面一層