إعداد الشريحة فحص النتائج تطبيق صبغة غرام
ضع القفازات وقم بربط الشعر الطويل للخلف لمنع تلوث العينة التي تقوم باختبارها. عقّم المنطقة التي تقوم بالعمل بها على أن تكون في منطقة جيدة التهوية. تأكد من أن موقد بنزن والمجهر يعملان بشكل جيد قبل البدء. إن كانت الشريحة متسخة فقم بغسلها بالماء والصابون لإزالة الدهون والأتربة. طهّر الشريحة بالكحول الإيثيلي ومنظف الزجاج أو أي طريقة أخرى مُوصى بها. يمكنك استخدام صبغة غرام للتأكد من وجود البكتيريا في العينات الطبية أو مزرعة البكتيريا التي تنمو على طبق بتري. لكي تكون الصبغة مفيدة، أضف طبقة رقيقة من العينة على الصبغة. ينصح باستخدام عينة لم تتجاوز 24 ساعة حيث إن البكتيريا التي يمضي عليها وقت أطول قد يصيب جدارها الخلوي بعض التلف وتصبح أقل استجابة للصبغة.  إن كنت تقوم باستخدام عينة نسيج، أضف قطرة أو قطرتين على الشريحة الزجاجية. قم بفردها بالتساوي لتحصل على مسحة رقيقة وذلك باستخدام حافة شريحة زجاجية أخرى، اتركها تجف في الهواء قبل المتابعة. إن كنت تستخدم بكتيريا مأخوذة من طبق بتري، فقم بتعقيم حلقة التلقيح بتسخينها على موقد بنزن حتى تتوهج. باستخدام الحلقة قم بوضع قطرة من الماء على الشريحة ثم أعد تعقيم الحلقة وتركها تبرد قبل استخدامها مجددًا في نقل عينة صغيرة من البكتيريا ومزجها بالماء.   يتم خلط البكتيريا الموجودة في هذا الخليط السائل بحركة دائرية، ثم تضاف بحلقة التلقيح كما هو بالأعلى، دون إضافة الكمية الباقية من الماء.   إن كان لديك عينة من مسحة، افرد المسحة برفق على جانب الشريحة. سيعمل التسخين على تثبيت البكتيريا على الشريحة فلا تنزلق بسهولة أثناء استخدام الصبغة. مرر الشريحة بسرعة مرتين أو ثلاثًا فوق لهب موقد بنزن أو قم بتسخينه على سخان كهربائي. تجنب الإفراط في التسخين حيث قد يفسد هذا العينة. في حال استخدام موقد بنزن لابد أن يكون اللهب منخفضًا، مخروطي الشكل أزرق اللون وليس طويلًا وبرتقاليًا.  يمكن بدلًا من هذا تثبيت الشريحة بالكحول الميثيلي وذلك بإضافة قطرة أو اثنتين من الميثانول على الشريحة الجافة وترك الميثانول الفائض يجف في الهواء. هذه الطريقة تقلل التلف الذي يلحق بخلايا المضيف مما يعطي العينة خلفية صافية. طبق الصبغة هو طبق مسطح مصنوع من المعدن أو الزجاج أو البلاستيك مثبت عبر فتحته العلوية شبكة أو سلك. ضع الشريحة على هذا السلك بحيث يمكن للسوائل التي ستستخدمها أن تتسرب عبر الشبكة.  إن لم يتوفر لديك طبق الصبغة يمكنك أن تضع الشريحة مباشرة على طبق مكعبات الثلج البلاستيكي. ضع الشريحة تحت المجهر الضوئي. تتفاوت أحجام البكتيريا بشكل كبير، لذا ستختلف درجة التكبير المستخدمة بين ×400 و×1000.  عند استخدام درجات التكبير الأعلى ينصح باستخدام عدسة الزيت لوضوح أكبر. قم بوضع قطرة زيت على الشريحة وتجنب الحركة أثناء وضع الزيت لتجنب تكون الفقاعات.  حرك برج الميكروسكوب حتى تصبح العدسة في مكانها وتلامس الزيت.  يمكن استخدام تقنية الغمر بالزيت مع عدسات خاصة وليس العدسات العادية "الجافة". قم بفحص الشريحة باستخدام الميكروسكوب لمشاهدة الأحياء الدقيقة تحت المجهر الضوئي. تبدو البكتيريا موجبة الغرام بلون بنفسجي، نتيجة احتجاز صبغة كريستال البنفسجية بداخل جدرانها الخلوية السميكة. بينما تبدو البكتيريا سالبة الغرام زهرية اللون أو بلون أحمر، بعد أن تم غسل اللون البنفسجي منها نتيجة لجدرانها الرقيقة ومن ثم تقوم الصبغة المضادة بدخول الجدار وتلوينه.   إن كانت العينة سميكة قد تشعر خطًا بان النتيجة موجبة. قم بإعداد شريحة جديدة إن وجدت أن كل البكتيريا موجبة الغرام للتأكد من صحة النتائج. إن تم وضع مزيل اللون لفترة طويلة فقد تأتي النتائج خطأ سالبة. قم بصبغ شريحة جديدة إن وجدت كل البكتيريا سالبة الغرام للتأكد من صحة النتائج. إن كنت غير متأكدً من نوع البكتيريا التي تراها فانظر إلى عدد من الصور المرجعية، المقسمة تبعًا للشكل ونوع الغرام. يمكنك أن تجد قاعدة بيانات لها عبر الإنترنت من خلال الروابط التالية: National Microbial Pathogen Database، Bacteria in Photos وغيرها من المواقع. ولتسهيل التفرقة بين النوعين تم وضع بعض الأمثلة التوضيحية بالأسفل بحسب نوع الغرام والشكل. البكتيريا مصنفة تبعًا لأشكالها تحت المجهر إلى كرويّة (دائرية) وعصويّة (أسطوانية). هنا بعض الأمثلة الشائعة للبكتيريا موجبة الغرام (باللون البنفسجي) مقسمة تبعًا للشكل:   "البكتيريا موجبة الغرام" هي إما "مكوّرات عنقودية" (أي تعيش في مستعمرات عنقودية الشكل) أو عنقوديات (أي تعيش في سلاسل). البكتيريا العصوية موجبة الغرام تشمل "الباسيلس"، "الكلوسترديوم"، "كوراينيبكتريام"، "اللستريا". أما "أكتينومايسس" فعادة ما تمتلك فروعًا أو خيوط. البكتيريا سالبة الغرام (وردية اللون) تقسم عادة إلى ثلاث مجموعات. المكورات وهي بكتيريا كروية الشكل، العصويات وهي طولية رفيعة الشكل والمكورات العصوية وتجمع بين صفاتيهما.   المكورات سالبة الغرام الأكثر شهرة هي "النايسيريا". تشمل العصويات سالبة الغرام "إي كولاي"، "إنتيروباكتر"، "كلابسيلا"، "سيتروباكتر"، "بروتيوس"، "سالمونيللا"، "شيجيللا"، "سودوموناس" وغيرها الكثير. يمكن أن تظهر فيبريو كوليرا " بشكلها العصوي العادي أو المعقوف.     العصويات المكورة سالبة الغرام  تشمل "بوردوتيللا"، "بروسيللا"، "هيموفيليس" ، "باستوريللا". من الصعب أحيانًا صبغ بعض البكتيريا لتعطي لونًا محددًا نتيجة رقة أو شمعية جدارها الخلوي. فتظهر بلون مختلط بين البنفسجي والوردي في نفس الخلية أو بداخل الخلايا المختلفة في نفس الشريحة. يمكن أن تحدث هذه المشكلة لأي عينة مضى عليها أكثر من 24 ساعة، إلا أن بعض الأنواع يصعب صبغها أيا كان عمر الشريحة. تحتاج هذه الأنواع إلى المزيد من الاختبارات المتقدمة للتعرف عليها مثل الصبغة المقاومة للحوامض وملاحظة نمو المزرعة أو الزراعة في وسط TSI أو الفحص الجيني.   تعد كلا من "أكتينومايسس"، "أرثوباكتر"، "كوراينبكرتيام"، "مايكوبكتريام"، "بروبيونيباكتريام" من البكتيريا موجبة الغرام ولكنها تظهر عادة بشكل غير واضح ما إذا كانت موجبة أم سالبة.   البكتيريا الصغيرة الأسطوانية مثل "تريبونيما" و"الكلاميديا" و"الركتيسيا" يصعب صبغها بالغرام. تختلف عملية التخلص من النفايات بين مختبر وآخر بحسب المواد المستخدمة، عادةً ما يتم التخلص من السائل المستخدم في طبق الصبغة في زجاجات مغلقة ومُعلّمة كمواد خطرة. ويتم غمر الشريحة في 10% من محلول منظف، ثم التخلص منها في حاويات النفايات الحادة. تتحلل صبغة كريستال البنفسجية في المحلول المائي إلى أيونات كريستال البنفسجية الموجبة وأيونات الكلوريد السالبة. هذه الأيونات تخترق جدار الخلية والغشاء الخلوي لكلا نوعي البكتيريا "سالبة الغرام وموجبة الغرام". وتتفاعل أيونات كريستال الموجبة مع المكونات سالبة الشحنة الموجودة في جدار الخلية لتقوم بصبغ الخلية باللون البنفسجي.  تستخدم عدة معامل صبغة كريستال "هوكر" البنفسجية والتي يضاف إليها أوكسالات الأمونيوم لمنع الترسيب. قم بإمالة الشريحة واستخدم زجاجة غسل لرشّ تيار من الماء المقطر أو ماء الصنبور أعلى الشريحة، سيجري الماء إلى الأسفل على سطح الشريحة ولكنه لن يكون مصوبًا بشكل مباشر عليها.  لا تغسل الشريحة بشكل زائد عن الحد، مما قد يزيل البقعة من عينة غرام الموجبة، فيجب عليك التعرف على الفارق بين البكتيريا والفيروسات. استخدم قطّارة لتغطية الشريحة باليود. دعه يستقر فوقها لمدة 60 ثانية على الأقل، ثم اغسلها بنفس الطريقة المذكورة سابقًا.  يتفاعل اليود في صورة أيونات سالبة الشحنة مع أيونات كريستال البنفسجية الموجبة ليكون مركب كبير من أيوديد كريستال البنفسجية في الطبقات الداخلية والخارجية من الخلية. مما يحجز اللون البنفسجي في الخلية.  اليود مادة كاوية فتجنب استنشاقه أو بلعه أو ملامسته للجلد. يستخدم عادةً مزيج بنسبة 1:1 من الأسيتون والإيثانول في هذه الخطوة الهامة والتي لابد أن يتم ضبط توقيت إجرائها بدقة. أمسك الشريحة بزاوية ثم أضف مزيل اللون حتى يختفي اللون البنفسجي من ماء الشطف. يستغرق هذا عادة أقل من 10 ثوان أو حتى أقل إن كان مزيل اللون يحتوي على تركيز أعلى من الأسيتون. توقف مباشرة وإلا سيقوم مزيل اللون بإزالة صبغة كريستال البنفسجية من الخلايا موجبة وسالبة الغرام وسيكون علينا إعادة وضع الصبغة. اشطف الكمية الباقية من مزيل اللون بسرعة باستخدام الطريقة السابق ذكرها.   يمكن استخدام الأسيتون النقي (الذي يبلغ تركيزه 95%) بدلًا من هذا.  كلما زادت كمية الأسيتون المستخدمة كلما كانت عملية إزالة اللون أسرع مما يستدعي ضبطًا أكثر للتوقيت. إن كنت تعاني من صعوبة في ضبط توقيت هذه الخطوة قم بإضافة مزيل اللون قطرة بعد قطرة. عادة ما تكون الصبغة المضادة السفرانين أو الفوكسين وتستخدم لإعطاء مزيد من التباين بين البكتريا السالبة الغرام والموجبة الغرام وذلك بإعطاء البكتيريا سالبة الغرام لونًا زهريًا أو أحمر.  اتركها لمدة 45 ثانية ثم قم بشطفها.  يعمل الفوكسين على صبغ الكثير من البكتيريا سالبة الغرام بلون أكثر حدة مثل "الهيموفيليس" و"اللجيونيللا". يشكل هذا خيارًا أفضل للمبتدئين. يمكنك ترك الشريحة لتجف في الهواء أو تجفيفها باستخدام ورق تجفيف يباع لهذا الغرض.  انتهت تجربة فحص العينة بملون غرام الآن.
قم بالإعداد للعمل المعملي. قم بتعقيم شريحة فحص مجهري زجاجية. أضف العينة على الشريحة. سخن العينة. ضع الشريحة على طبق الصبغة. إعداد الميكروسكوب الضوئي. افحص البكتيريا سالبة وموجبة الغرام. راجع الصور المرجعية. قسم البكتيريا موجبة الغرام بحسب الشكل. للتعرف على البكتيريا سالبة الغرام. تقييم النتائج المختلطة. التخلص من المواد. أغرق الشريحة بسائل كريستال البنفسجي، استخدم القطّارة لإغراق البكتيريا في عدة قطرات من صبغة كريستال البنفسجية والتي تسمى أحيانًا صبغة جنتيان البنفسجية. اغسل صبغة كريستال برفق. أغرق الشريحة باليود ثم اشطفها. أضف مزيل اللون ثم اشطف بسرعة. أغرق الشريحة بالصبغة المضادة، ثم اشطفها. جفف الشريحة.
https://www.wikihow.com/Gram-Stain https://www.wikihow.com/Gram-Stain https://www.wikihow.com/Gram-Stain
Preparing a Gram Stain Examining the Result Performing the Gram Stain