b'\n_START_ARTICLE_\nPiruvato quinase\n_START_SECTION_\nEnsaios\n_START_PARAGRAPH_\nA detec\xc3\xa7\xc3\xa3o da atividade da piruvato quinase pode ser associada \xc3\xa0 concentra\xc3\xa7\xc3\xa3o de produto formado. Um exemplo \xc3\xa9 a detec\xc3\xa7\xc3\xa3o de piruvato, um dos produtos da rea\xc3\xa7\xc3\xa3o catalisada pela enzima, por colorimetria ou fluorimetria. Al\xc3\xa9m da piruvato quinase, adiciona-se a piruvato oxidase \xc3\xa0 rea\xc3\xa7\xc3\xa3o, que oxida o piruvato gerado produzindo cor (a \xce\xbb = 570 nm) e fluoresc\xc3\xaancia (a Ex/Em = 535/587 nm).\n_START_SECTION_\nInibidores\n_START_PARAGRAPH_\nDentre os inibidores da piruvato quinase em humanos est\xc3\xa3o os produtos da rea\xc3\xa7\xc3\xa3o catalisada por ela na glic\xc3\xb3lise - ATP e fosfoenolpiruvato -, al\xc3\xa9m de frutose 1,6-bisfosfato, alanina, fenilalanina, ciste\xc3\xadna, valina, \xc3\xa1cido lisofosfat\xc3\xaddico, oxalato, dentre outros.\n_START_SECTION_\nPurifica\xc3\xa7\xc3\xa3o\n_START_PARAGRAPH_\nPara a purifica\xc3\xa7\xc3\xa3o de piruvato quinase utilizam-se v\xc3\xa1rios passos que incluem cromatografia de troca i\xc3\xb4nica e afinidade. Primeiramente, a enzima \xc3\xa9 isolada com o tecido, precipitada com sulfato de am\xc3\xb4nia e submetida a uma coluna de filtra\xc3\xa7\xc3\xa3o em gel (para dessalinizar e carregar negativamente a amostra). Passa ent\xc3\xa3o por colunas cati\xc3\xb4nicas (cromatografia de troca i\xc3\xb4nica), onde grande quantidade de prote\xc3\xadna \xc3\xa9 elu\xc3\xadda com as lavagens. A elui\xc3\xa7\xc3\xa3o da piruvato quinase \xc3\xa9 feita utilizando-se efetores alost\xc3\xa9ricos, resultando em uma recupera\xc3\xa7\xc3\xa3o de 60% da enzima. Dentre os v\xc3\xa1rios efetores alost\xc3\xa9ricos testados (tanto positivos quanto negativos) e de mais de um tipo de tamp\xc3\xa3o, o mais efetivo na elui\xc3\xa7\xc3\xa3o da piruvato quinase e que n\xc3\xa3o modificou significativamente sua atividade espec\xc3\xadfica foi a frutose 1,6-bisfosfato (FBP). Tamb\xc3\xa9m \xc3\xa9 poss\xc3\xadvel separar as isoformas L e M da enzima, uma vez que s\xc3\xb3 a L \xc3\xa9 elu\xc3\xadda com o efetor alost\xc3\xa9rico. Este foi o primeiro trabalho que tornou poss\xc3\xadvel a separa\xc3\xa7\xc3\xa3o do complexo FBP e piruvato quinase, permitindo que o papel da FBP na piruvato quinase fosse avaliado. At\xc3\xa9 aquele momento, a separa\xc3\xa7\xc3\xa3o das duas enzimas era dif\xc3\xadcil devido \xc3\xa0s suas propriedades cromatogr\xc3\xa1ficas muito similares.\n_START_SECTION_\nEfeito do pH na atividade da enzima\n_START_PARAGRAPH_\nDe acordo com a avalia\xc3\xa7\xc3\xa3o do comportamento da piruvato quinase em diferentes pHs, foi poss\xc3\xadvel observar que seu pH \xc3\xb3timo \xc3\xa9 em torno de 7,2. Com o c\xc3\xa1lculo do log da velocidade m\xc3\xa1xima da rea\xc3\xa7\xc3\xa3o catalisada pela enzima em faixas abrangentes de pH (de \xc3\xa1cidos a alcalinos), obt\xc3\xa9m-se um padr\xc3\xa3o de curva sugestivo de dois grupos ioniz\xc3\xa1veis na enzima.\n_START_SECTION_\nDefici\xc3\xaancia de Piruvato Quinase (PKD)\n_START_PARAGRAPH_\nVisto que esta enzima \xc3\xa9 essencial principalmente para c\xc3\xa9lulas que utilizam a glic\xc3\xb3lise como principal fonte de energia, como os neur\xc3\xb4nios e as hem\xc3\xa1cias, qualquer defici\xc3\xaancia na via causa s\xc3\xa9rios danos e em alguns casos pode at\xc3\xa9 ser fatal. A defici\xc3\xaancia de piruvato quinase foi descrita em 1961 e \xc3\xa9 uma doen\xc3\xa7a autoss\xc3\xb4mica recessiva. Em hem\xc3\xa1cias, por exemplo, resulta em anemia hemol\xc3\xadtica cong\xc3\xaanita, na qual as c\xc3\xa9lulas sofrem danos variados devido \xc3\xa0 falta de 50% de seu total de ATP, que seria produzido pela piruvato quinase. Em rec\xc3\xa9m-nascidos, a hiperbilirrubinemia severa de causa n\xc3\xa3o identificada deve ser sempre considerada como um poss\xc3\xadvel ind\xc3\xadcio de PKD. Crian\xc3\xa7as com PKD podem ser dependentes de transfus\xc3\xa3o por anos at\xc3\xa9 a esplenectomia, ou mesmo depois da cirurgia. A anemia \xc3\xa9 controlada na fase adulta, mas em per\xc3\xadodos de estresse, gravidez ou infec\xc3\xa7\xc3\xb5es agudas, pode ser exacerbada. A PKD \xc3\xa9 considerada em pacientes com hem\xc3\xb3lise ativa sem nenhuma sugest\xc3\xa3o de processo autoimune, defeitos na membrana das hem\xc3\xa1cias ou hemoglobinopatia. Sem um hist\xc3\xb3rico familiar, o diagn\xc3\xb3stico da PKD torna-se complicado. O teste de piruvato quinase \xc3\xa9, historicamente, o padr\xc3\xa3o ouro no diagn\xc3\xb3stico da doen\xc3\xa7a, mas s\xc3\xb3 recentemente vem sendo inserido o teste do gene PK-LR (gene da isoforma R de piruvato quinase, a isoforma suscet\xc3\xadvel \xc3\xa0 PKD e presente em f\xc3\xadgado e eritr\xc3\xb3citos). Outras complica\xc3\xa7\xc3\xb5es podem advir da PKD, como hematopoiese extramedular, incluindo les\xc3\xb5es que causam compress\xc3\xa3o da medula espinhal. Acredita-se que futuramente terapias g\xc3\xaanicas estar\xc3\xa3o dispon\xc3\xadveis para o tratamento da doen\xc3\xa7a em humanos, uma vez que estudos em camundongos com vetores virais contendo o gene da piruvato quinase de f\xc3\xadgado humano, resultam em express\xc3\xa3o prolongada de piruvato quinase nas c\xc3\xa9lulas vermelhas e \xc3\xb3rg\xc3\xa3os hematopoi\xc3\xa9ticos. Al\xc3\xa9m disso, um ativador farmacol\xc3\xb3gico da piruvato quinase de c\xc3\xa9lulas vermelhas est\xc3\xa1 nos est\xc3\xa1gios iniciais de testes cl\xc3\xadnicos.'