b'\n_START_ARTICLE_\nRecombineering\n_START_PARAGRAPH_\nRecombineering (fr\xc3\xa5n engelskans "recombination-mediated genetic engineering") \xc3\xa4r en genetisk och molekyl\xc3\xa4rbiologisk teknik baserad p\xc3\xa5 homolog rekombination, till skillnad fr\xc3\xa5n de \xc3\xa4ldre och mer vanliga metoderna att med hj\xc3\xa4lp av restriktionsenzymer och ligas sammanfoga DNA-sekvenser i en specifik ordning. Recombineering anv\xc3\xa4nds ofta inom bakteriell genetik, f\xc3\xb6r att skapa vektorer f\xc3\xb6r att g\xc3\xb6ra knockoutm\xc3\xb6ss, f\xc3\xb6r att modifiera DNA klonat p\xc3\xa5 plasmider i bakterier, samt inom andra applikationer.\n_START_SECTION_\nUtveckling\n_START_PARAGRAPH_\nTrots att det utvecklats i bakterier kom mycket av inspirationen till recombineering-tekniker fr\xc3\xa5n metoder som utvecklades i j\xc3\xa4sten Saccharomyces cerevisiae  d\xc3\xa4r en linj\xc3\xa4r plasmid kunde anv\xc3\xa4ndas f\xc3\xb6r att sl\xc3\xa5 ut gener eller klona gener fr\xc3\xa5n kromosomen. Dessutom visades rekombination med enkelstr\xc3\xa4ngade oligonukleotider f\xc3\xb6r f\xc3\xb6rsta g\xc3\xa5ngen i Saccharomyces cerevisiae. Rekombination kunde observeras med oligonukleotider s\xc3\xa5 korta som 20 baser._NEWLINE_Recombineering \xc3\xa4r baserad p\xc3\xa5 homolog rekombination i Escherichia coli med hj\xc3\xa4lp av proteiner fr\xc3\xa5n bakteriofager, antingen RecE/RecT fr\xc3\xa5n Rac-profagen eller Red\xce\xb1\xce\xb2\xce\xb4 fr\xc3\xa5n bakteriofag lambda. Det mest anv\xc3\xa4nda systemet f\xc3\xb6r recombineering \xc3\xa4r idag "Lambda Red", baserat p\xc3\xa5 Red\xce\xb1\xce\xb2\xce\xb4, och de f\xc3\xb6rsta demonstrationerna av Lambda Red in vivo gjordes av Kenan Murphy och Francis Stewart, oberoende av varandra. Murphys experiment kr\xc3\xa4vde dock uttryck av RecA och l\xc3\xa5nga str\xc3\xa4ckor homologi, och p\xc3\xa5 grund av detta var potentialen i denna nya DNA-teknik inte uppenbar. Stewart-labbet kunde visa att dessa system f\xc3\xb6r homolog rekombination effektivt kunde mediera rekombination av linj\xc3\xa4ra DNA-molekyler flankerade av homologa sekvenser s\xc3\xa5 korta som 30 baspar (40-50 baspar \xc3\xa4r dock effektivare) till m\xc3\xa5lsekvenserna \xc3\xa4ven utan uttryck av RecA. Nu kunde dessa homologier genereras genom syntetiska oligonukleotider gjorda p\xc3\xa5 best\xc3\xa4llning, vilket kraftigt ut\xc3\xb6kade nyttan av recombineering.\n_START_SECTION_\nRecombineering med dsDNA\n_START_PARAGRAPH_\nRecombineering anv\xc3\xa4nder ett linj\xc3\xa4rt DNA-substrat som \xc3\xa4r antingen dubbelstr\xc3\xa4ngat (dsDNA) eller enkelstr\xc3\xa4ngat (ssDNA). Recombineering  med dubbelstr\xc3\xa4ngat DNA har anv\xc3\xa4nts f\xc3\xb6r att ers\xc3\xa4tta gener, ta bort gener, infoga gener, samt generera inversioner. Genkloning  och m\xc3\xa4rkning av gener/proteiner (His-taggar etc., se ) \xc3\xa4r en annan vanlig till\xc3\xa4mpning. F\xc3\xb6r att ers\xc3\xa4tta eller ta bort gener anv\xc3\xa4nds oftast en kassett som inneh\xc3\xa5ller en gen som kodar f\xc3\xb6r resistens mot en viss antibiotika, genererad med hj\xc3\xa4lp av PCR med primer som inneh\xc3\xa5ller l\xc3\xa4mpliga homologier. Dessa primers best\xc3\xa5r av (fr\xc3\xa5n 5\'\xe2\x86\x923\') 40-50 baser av homologi till den genetiska regionen d\xc3\xa4r kassetten ska inf\xc3\xb6ras, f\xc3\xb6ljt av cirka 20 baser som binder till resistenskassetten. Den exakta \xc3\xb6verg\xc3\xa5ngssekvensen vid skarven mellan genomisk sekvens och infogad resistenskassett best\xc3\xa4ms genom primerdesign. Integrering genom homolog rekombination uppst\xc3\xa5r ofta vid en frekvens av cirka 10\xe2\x81\xb4/10\xe2\x81\xb8celler som \xc3\xb6verlever elektroporeringen. Elektroporering \xc3\xa4r den metod som anv\xc3\xa4nds f\xc3\xb6r att f\xc3\xb6ra in det linj\xc3\xa4ra DNA-fragmentet i de mottagande cellerna.\n_START_SECTION_\nSelektion/motselektionstekniker\n_START_PARAGRAPH_\nI vissa fall \xc3\xa4r det \xc3\xb6nskv\xc3\xa4rt att ta bort en gen utan att l\xc3\xa4mna kvar en genetisk mark\xc3\xb6r, att skapa en genfusion, eller att skapa en punktmutation i en viss gen. Detta kan g\xc3\xb6ras genom tv\xc3\xa5 omg\xc3\xa5ngar rekombination. I det f\xc3\xb6rsta steget av recombineering s\xc3\xa4tts en selektionsmark\xc3\xb6r p\xc3\xa5 en kassett in f\xc3\xb6r att ers\xc3\xa4tta den genetiska regionen som ska \xc3\xa4ndras. I det andra steget selekterar man mot en toxisk motselektionsmark\xc3\xb6r (t.ex. sacB) p\xc3\xa5 kassetten efter inf\xc3\xb6randet av nytt DNA-fragment som inneh\xc3\xa5ller den \xc3\xb6nskade \xc3\xa4ndringen. Alternativt kan den infogade sekvensen vara flankerad av loxP eller FRT-sekvenser, som kan tas bort senare genom uttryck av Cre eller FLP-rekombinas.\n_START_SECTION_\nRecombineering med ssDNA\n_START_PARAGRAPH_\nRecombineering med ssDNA var ett genombrott, b\xc3\xa5de i effektivitet och med avseende p\xc3\xa5 enkelhet att g\xc3\xb6ra punktmutationer. Denna teknik f\xc3\xb6rb\xc3\xa4ttrades ytterligare av uppt\xc3\xa4ckten att man genom att undvika cellens metyleringsstyrda DNA-reparationssystem kan \xc3\xb6ka frekvensen rekombinanter till \xc3\xb6ver 10\xe2\x81\xb7/10\xe2\x81\xb8 levande celler. Denna frekvens \xc3\xa4r tillr\xc3\xa4ckligt h\xc3\xb6g f\xc3\xb6r att m\xc3\xb6jligg\xc3\xb6ra \xc3\xa4ndringar utan selektion. Med optimerade protokoll kan \xc3\xb6ver 50% av de celler som \xc3\xb6verlever elektroporeringen inneh\xc3\xa5lla den \xc3\xb6nskade f\xc3\xb6r\xc3\xa4ndringen. Recombineering med ssDNA kr\xc3\xa4ver enbart Red Beta-protein, Exo -, Gamma och den mottagande cellens rekombinationsproteiner beh\xc3\xb6vs inte. Eftersom proteiner homologa med Beta och RecT finns i m\xc3\xa5nga bakterier och bakteriofager (>100 februari 2010), \xc3\xa4r det sannolikt att recombineering kan fungera i m\xc3\xa5nga olika sorters bakterier. Detta medf\xc3\xb6r att recombineering med ssDNA ut\xc3\xb6kar de genetiska verktyg som finns tillg\xc3\xa4ngliga f\xc3\xb6r forskning i en rad olika organismer. Hittills har recombineering utf\xc3\xb6rts i E. coli, S. enterica, Y. pseudotuberculosis, S. cerevisiae och M. tuberculosis.\n_START_SECTION_\nRed-Independent recombination\n_START_PARAGRAPH_\n\xc3\x85r 2010 visades det att ssDNA rekombination kan ske \xc3\xa4ven i fr\xc3\xa5nvaro av k\xc3\xa4nda rekombinationsfunktioner.\n_START_SECTION_\nF\xc3\xb6rdelar med recombineering\n_START_PARAGRAPH_\nDen st\xc3\xb6rsta f\xc3\xb6rdelen med recombineering \xc3\xa4r att det \xc3\xa4r en teknik som \xc3\xa4r oberoende av l\xc3\xa4mpligt placerade restriktionssekvenser, medan DNA-modifiering genom konventionell genteknik ofta begr\xc3\xa4nsas av tillg\xc3\xa5ngen av unika restriktionssekvenser. F\xc3\xb6r att kunna g\xc3\xb6ra stora genetiska konstruktioner >100 kb, exempelvis Bakteriella Artificiella Kromosomer (BACs), eller kromosomer, har recombineering blivit en n\xc3\xb6dv\xc3\xa4ndighet. Recombineering kan skapa de \xc3\xb6nskade \xc3\xa4ndringarna utan att l\xc3\xa4mna n\xc3\xa5gra \'fotsp\xc3\xa5r\' eller \'\xc3\xa4rr\' i sekvensen. Det tar ocks\xc3\xa5 bort flera kloningssteg f\xc3\xb6r att skapa mellanstegs-vektorer och anv\xc3\xa4nds d\xc3\xa4rf\xc3\xb6r f\xc3\xb6r att modifiera DNA-konstruktioner p\xc3\xa5 en relativt kort tid. Den homologi som kr\xc3\xa4vs \xc3\xa4r kort nog att genereras i syntetiska oligonukleotider, och rekombination med enbart korta oligonukleotider \xc3\xa4r otroligt effektiv. Recombineering har ocks\xc3\xa5 automatiserats i en process som kallas "MAGE" - Multiplex Automated Genome Engineering, i George Church lab.'