इन विट्रो विश्लेषण करने के लिए, एक प्रोटीन को अन्य सेलुलर घटकों से दूर शुद्ध किया जाना चाहिए। यह प्रक्रिया आम तौर पर कोशिका लसीका से शुरू होती है, जिसमें कोशिका की झिल्ली बाधित हो जाती है और इसकी आंतरिक सामग्री एक घोल में निकल जाती है जिसे क्रूड लाइसेट कहा जाता है। परिणामी मिश्रण को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है, जो विभिन्न सेलुलर घटकों को घुलनशील प्रोटीन वाले अंशों में विभाजित करता है; झिल्लीदार लिपिड और प्रोटीन; सेलुलर ऑर्गेनेल, और न्यूक्लिक एसिड। सॉल्टिंग आउट नामक विधि द्वारा अवक्षेपण इस लाइसेट से प्रोटीन को केंद्रित कर सकता है। आणविक भार, शुद्ध आवेश और बाइंडिंग एफ़िनिटी जैसे गुणों के आधार पर प्रोटीन या रुचि के प्रोटीन को अलग करने के लिए विभिन्न प्रकार की क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। यदि वांछित प्रोटीन का आणविक भार और आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु ज्ञात है, तो विभिन्न प्रकार के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके शुद्धि के स्तर की निगरानी की जा सकती है, यदि प्रोटीन में विशिष्ट स्पेक्ट्रोस्कोपिक विशेषताएं हैं, तो स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा, या यदि प्रोटीन में एंजाइमेटिक गतिविधि है तो एंजाइम परख द्वारा। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफोकसिंग का उपयोग करके प्रोटीन को उनके चार्ज के अनुसार अलग किया जा सकता है। प्राकृतिक प्रोटीन के लिए, प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए शुद्धिकरण चरणों की एक श्रृंखला आवश्यक हो सकती है। इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, आनुवंशिक इंजीनियरिंग का उपयोग अक्सर प्रोटीन में रासायनिक विशेषताएं जोड़ने के लिए किया जाता है जो उनकी संरचना या गतिविधि को प्रभावित किए बिना उन्हें शुद्ध करना आसान बनाता है। यहां, एक विशिष्ट अमीनो एसिड अनुक्रम से युक्त एक "टैग", अक्सर हिस्टिडीन अवशेषों की एक श्रृंखला ("हिज़-टैग"), प्रोटीन के एक टर्मिनस से जुड़ा होता है। परिणामस्वरूप, जब लाइसेट को निकेल युक्त क्रोमैटोग्राफी कॉलम के ऊपर से गुजारा जाता है, तो हिस्टिडाइन अवशेष निकल को लिगेट करते हैं और कॉलम से जुड़ जाते हैं, जबकि लाइसेट के अनटैग किए गए घटक बिना किसी बाधा के गुजरते हैं। शोधकर्ताओं को जटिल मिश्रण से विशिष्ट प्रोटीन को शुद्ध करने में मदद करने के लिए कई अलग-अलग टैग विकसित किए गए हैं।
अन्य सेलुलर घटकों से दूर शुद्ध किया जाना चाहिए
इन विट्रो विश्लेषण करने के लिए, एक प्रोटीन को अन्य सेलुलर घटकों से दूर शुद्ध किया जाना चाहिए। यह प्रक्रिया आम तौर पर कोशिका लसीका से शुरू होती है, जिसमें कोशिका की झिल्ली बाधित हो जाती है और इसकी आंतरिक सामग्री एक घोल में निकल जाती है जिसे क्रूड लाइसेट कहा जाता है। परिणामी मिश्रण को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है, जो विभिन्न सेलुलर घटकों को घुलनशील प्रोटीन वाले अंशों में विभाजित करता है; झिल्लीदार लिपिड और प्रोटीन; सेलुलर ऑर्गेनेल, और न्यूक्लिक एसिड। सॉल्टिंग आउट नामक विधि द्वारा अवक्षेपण इस लाइसेट से प्रोटीन को केंद्रित कर सकता है। आणविक भार, शुद्ध आवेश और बाइंडिंग एफ़िनिटी जैसे गुणों के आधार पर प्रोटीन या रुचि के प्रोटीन को अलग करने के लिए विभिन्न प्रकार की क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। यदि वांछित प्रोटीन का आणविक भार और आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु ज्ञात है, तो विभिन्न प्रकार के जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके शुद्धि के स्तर की निगरानी की जा सकती है, यदि प्रोटीन में विशिष्ट स्पेक्ट्रोस्कोपिक विशेषताएं हैं, तो स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा, या यदि प्रोटीन में एंजाइमेटिक गतिविधि है तो एंजाइम परख द्वारा। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफोकसिंग का उपयोग करके प्रोटीन को उनके चार्ज के अनुसार अलग किया जा सकता है। प्राकृतिक प्रोटीन के लिए, प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए शुद्धिकरण चरणों की एक श्रृंखला आवश्यक हो सकती है। इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, आनुवंशिक इंजीनियरिंग का उपयोग अक्सर प्रोटीन में रासायनिक विशेषताएं जोड़ने के लिए किया जाता है जो उनकी संरचना या गतिविधि को प्रभावित किए बिना उन्हें शुद्ध करना आसान बनाता है। यहां, एक विशिष्ट अमीनो एसिड अनुक्रम से युक्त एक "टैग", अक्सर हिस्टिडीन अवशेषों की एक श्रृंखला ("हिज़-टैग"), प्रोटीन के एक टर्मिनस से जुड़ा होता है। परिणामस्वरूप, जब लाइसेट को निकेल युक्त क्रोमैटोग्राफी कॉलम के ऊपर से गुजारा जाता है, तो हिस्टिडाइन अवशेष निकल को लिगेट करते हैं और कॉलम से जुड़ जाते हैं, जबकि लाइसेट के अनटैग किए गए घटक बिना किसी बाधा के गुजरते हैं। शोधकर्ताओं को जटिल मिश्रण से विशिष्ट प्रोटीन को शुद्ध करने में मदद करने के लिए कई अलग-अलग टैग विकसित किए गए हैं।