1927 तक, फ्लेमिंग स्टेफिलोकोसी के गुणों की जांच कर रहे थे। वह अपने पहले के काम से पहले से ही प्रसिद्ध थे, और एक शानदार शोधकर्ता के रूप में उनकी प्रतिष्ठा विकसित हुई थी। 1928 में, जोसेफ वारविक बिगर के काम के बाद, उन्होंने प्राकृतिक परिस्थितियों में उगाए गए स्टैफिलोकोकस ऑरियस की विविधता का अध्ययन किया, जिन्होंने पाया कि जीवाणु विभिन्न प्रकार (उपभेदों) में विकसित हो सकता है। 3 सितंबर 1928 को, फ्लेमिंग सफ़ोल्क में अपने परिवार के साथ छुट्टियां बिताकर अपनी प्रयोगशाला में लौट आए। अपनी छुट्टियों पर जाने से पहले, उन्होंने कल्चर प्लेटों पर स्टेफिलोकोसी का टीका लगाया और उन्हें अपनी प्रयोगशाला के एक कोने में एक बेंच पर छोड़ दिया। अपनी वापसी पर, फ्लेमिंग ने देखा कि एक संस्कृति कवक से दूषित हो गई थी, और कवक के आसपास की स्टेफिलोकोसी की कालोनियां नष्ट हो गई थीं, जबकि दूर स्थित अन्य स्टेफिलोकोकी कालोनियां सामान्य थीं, उन्होंने प्रसिद्ध टिप्पणी करते हुए कहा, "यह हास्यास्पद है"। फ्लेमिंग ने दूषित संस्कृति को अपने पूर्व सहायक मर्लिन प्राइसे को दिखाया, जिन्होंने उन्हें याद दिलाया, "इसी तरह आपने लाइसोजाइम की खोज की थी।" उन्होंने इस साँचे की पहचान जीनस पेनिसिलियम से की। उन्हें संदेह था कि यह पी. क्राइसोजेनम है, लेकिन एक सहयोगी चार्ल्स जे. ला टौचे ने इसकी पहचान पी. रुब्रम के रूप में की। (इसे बाद में पी. नोटेटम के रूप में सुधारा गया और फिर आधिकारिक तौर पर पी. क्राइसोजेनम के रूप में स्वीकार किया गया; 2011 में, इसे पी. रूबेन्स के रूप में हल किया गया।)
वह प्रयोगशाला जिसमें फ्लेमिंग ने पेनिसिलिन की खोज और परीक्षण किया था, सेंट मैरी अस्पताल, पैडिंगटन में अलेक्जेंडर फ्लेमिंग प्रयोगशाला संग्रहालय के रूप में संरक्षित है। कवक संदूषक का स्रोत 1966 में स्थापित किया गया था कि यह ला टौचे के कमरे से आ रहा था, जो सीधे फ्लेमिंग के कमरे के नीचे था।
फ्लेमिंग ने साँचे को शुद्ध कल्चर में विकसित किया और पाया कि कल्चर शोरबा में एक जीवाणुरोधी पदार्थ होता है। उन्होंने कई जीवों पर इसके जीवाणुरोधी प्रभाव की जांच की, और देखा कि यह स्टेफिलोकोसी और कई अन्य ग्राम-पॉजिटिव रोगजनकों जैसे बैक्टीरिया को प्रभावित करता है जो स्कार्लेट ज्वर, निमोनिया, मेनिनजाइटिस और डिप्थीरिया का कारण बनते हैं, लेकिन टाइफाइड बुखार या पैराटाइफाइड बुखार पर नहीं, जो किसके कारण होते हैं ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, जिसके लिए वह उस समय इलाज की तलाश कर रहा था। इसने निसेरिया गोनोरिया को भी प्रभावित किया, जो गोनोरिया का कारण बनता है, हालांकि यह जीवाणु ग्राम-नेगेटिव है। कुछ महीनों तक इसे "मोल्ड जूस" या "अवरोधक" कहने के बाद, उन्होंने मोल्ड में मौजूद जीवाणुरोधी पदार्थ के लिए 7 मार्च 1929 को पेनिसिलिन नाम दिया।
पेनिसिलिन में कई ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया का एंटी-बैक्टीरियल प्रभाव होता है, जिसमें मेनिनजाइटिस, डिप्थीरिया, निमोनिया, स्कार्लेट ज्वर पैदा करने वाले बैक्टीरिया शामिल हैं, लेकिन यह इन्हीं तक सीमित नहीं है। यह (ग्राम-पॉजिटिव) स्टेफिलोकोसी बैक्टीरिया पर भी कार्य करता है जो त्वचा और नरम ऊतकों जैसे फोड़े-फुन्सियों में संक्रमण का कारण बनता है। पेनिसिलिन का ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया पर भी एंटी-बैक्टीरियल प्रभाव पाया गया जो गोनोरिया का कारण बनता है। आकस्मिक परिस्थितियों की एक श्रृंखला थी जो पेनिसिलिन की खोज की अनुमति देने के लिए संयुक्त थी, जिनमें से एक सर अलेक्जेंडर द्वारा प्रस्थान से पहले अपनी प्रयोगशाला में एक संस्कृति में स्टेफिलोकोसी बैक्टीरिया छोड़ने के बाद अपने परिवार के साथ छुट्टियां मनाने का विकल्प था। किस्सा यह है कि सर एलेक्जेंडर प्रयोगशाला की स्वच्छता को लेकर थोड़े लापरवाह थे, जिसने लाइसोजाइम की उनकी पिछली खोज में योगदान दिया और ऐसा लगता है कि देखभाल की वही कमी पेनिसिलिन की खोज के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार थी। अंततः उनकी प्रयोगशाला और संस्कृतियों के विशिष्ट स्थान ने एक भूमिका निभाई - फंगल संदूषक जिसका स्टेफिलोकोसी संस्कृति पर जीवाणुरोधी प्रभाव था, सर अलेक्जेंडर के सहयोगियों की प्रयोगशाला से एक मंजिल नीचे आया था
1927 तक, फ्लेमिंग स्टेफिलोकोसी के गुणों की जांच कर रहे थे। वह अपने पहले के काम से पहले से ही प्रसिद्ध थे, और एक शानदार शोधकर्ता के रूप में उनकी प्रतिष्ठा विकसित हुई थी। 1928 में, जोसेफ वारविक बिगर के काम के बाद, उन्होंने प्राकृतिक परिस्थितियों में उगाए गए स्टैफिलोकोकस ऑरियस की विविधता का अध्ययन किया, जिन्होंने पाया कि जीवाणु विभिन्न प्रकार (उपभेदों) में विकसित हो सकता है। 3 सितंबर 1928 को, फ्लेमिंग सफ़ोल्क में अपने परिवार के साथ छुट्टियां बिताकर अपनी प्रयोगशाला में लौट आए। अपनी छुट्टियों पर जाने से पहले, उन्होंने कल्चर प्लेटों पर स्टेफिलोकोसी का टीका लगाया और उन्हें अपनी प्रयोगशाला के एक कोने में एक बेंच पर छोड़ दिया। अपनी वापसी पर, फ्लेमिंग ने देखा कि एक संस्कृति कवक से दूषित हो गई थी, और कवक के आसपास की स्टेफिलोकोसी की कालोनियां नष्ट हो गई थीं, जबकि दूर स्थित अन्य स्टेफिलोकोकी कालोनियां सामान्य थीं, उन्होंने प्रसिद्ध टिप्पणी करते हुए कहा, "यह हास्यास्पद है"। फ्लेमिंग ने दूषित संस्कृति को अपने पूर्व सहायक मर्लिन प्राइसे को दिखाया, जिन्होंने उन्हें याद दिलाया, "इसी तरह आपने लाइसोजाइम की खोज की थी।" उन्होंने इस साँचे की पहचान जीनस पेनिसिलियम से की। उन्हें संदेह था कि यह पी. क्राइसोजेनम है, लेकिन एक सहयोगी चार्ल्स जे. ला टौचे ने इसकी पहचान पी. रुब्रम के रूप में की। (इसे बाद में पी. नोटेटम के रूप में सुधारा गया और फिर आधिकारिक तौर पर पी. क्राइसोजेनम के रूप में स्वीकार किया गया; 2011 में, इसे पी. रूबेन्स के रूप में हल किया गया।)
वह प्रयोगशाला जिसमें फ्लेमिंग ने पेनिसिलिन की खोज और परीक्षण किया था, सेंट मैरी अस्पताल, पैडिंगटन में अलेक्जेंडर फ्लेमिंग प्रयोगशाला संग्रहालय के रूप में संरक्षित है। कवक संदूषक का स्रोत 1966 में स्थापित किया गया था कि यह ला टौचे के कमरे से आ रहा था, जो सीधे फ्लेमिंग के कमरे के नीचे था।
फ्लेमिंग ने साँचे को शुद्ध कल्चर में विकसित किया और पाया कि कल्चर शोरबा में एक जीवाणुरोधी पदार्थ होता है। उन्होंने कई जीवों पर इसके जीवाणुरोधी प्रभाव की जांच की, और देखा कि यह स्टेफिलोकोसी और कई अन्य ग्राम-पॉजिटिव रोगजनकों जैसे बैक्टीरिया को प्रभावित करता है जो स्कार्लेट ज्वर, निमोनिया, मेनिनजाइटिस और डिप्थीरिया का कारण बनते हैं, लेकिन टाइफाइड बुखार या पैराटाइफाइड बुखार पर नहीं, जो किसके कारण होते हैं ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, जिसके लिए वह उस समय इलाज की तलाश कर रहा था। इसने निसेरिया गोनोरिया को भी प्रभावित किया, जो गोनोरिया का कारण बनता है, हालांकि यह जीवाणु ग्राम-नेगेटिव है। कुछ महीनों तक इसे "मोल्ड जूस" या "अवरोधक" कहने के बाद, उन्होंने मोल्ड में मौजूद जीवाणुरोधी पदार्थ के लिए 7 मार्च 1929 को पेनिसिलिन नाम दिया।