डार्नली द्वारा मैरी के बेटे, जेम्स का जन्म 19 जून 1566 को एडिनबर्ग कैसल में हुआ था, लेकिन रिज़ियो की हत्या के कारण अनिवार्य रूप से उसकी शादी टूट गई। अक्टूबर 1566 में, स्कॉटिश बॉर्डर के जेडबर्ग में रहने के दौरान, मैरी ने हर्मिटेज कैसल में अर्ल ऑफ बोथवेल से मिलने के लिए प्रत्येक रास्ते पर कम से कम चार घंटे की घोड़े पर यात्रा की, जहां वह सीमा नदियों के साथ झड़प में लगे घावों से बीमार पड़ गए थे। इस सवारी को बाद में मैरी के दुश्मनों द्वारा सबूत के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि दोनों प्रेमी थे, हालांकि उस समय कोई संदेह व्यक्त नहीं किया गया था और मैरी के साथ उसके पार्षद और गार्ड भी थे। जेडबर्ग लौटने के तुरंत बाद, उन्हें एक गंभीर बीमारी का सामना करना पड़ा जिसमें लगातार उल्टी, दृष्टि की हानि, भाषण की हानि, आक्षेप और बेहोशी की अवधि शामिल थी। ऐसा माना जाता था कि वह मृत्यु के निकट है या मर रही है। 25 अक्टूबर के बाद उनकी रिकवरी का श्रेय उनके फ्रांसीसी चिकित्सकों के कौशल को दिया गया। उसकी बीमारी का कारण अज्ञात है; निदान में शारीरिक थकावट और मानसिक तनाव, गैस्ट्रिक अल्सर से रक्तस्राव और पोरफाइरिया शामिल हैं। नवंबर 1566 के अंत में, एडिनबर्ग के पास क्रेगमिलर कैसल में, मैरी और प्रमुख रईसों ने "डार्नली की समस्या" पर चर्चा करने के लिए एक बैठक की। तलाक पर चर्चा की गई थी, लेकिन डार्नली को अन्य तरीकों से हटाने के लिए संभवतः उपस्थित राजाओं के बीच एक बंधन की शपथ ली गई थी: "यह सामान्य धन के लिए समीचीन और सबसे अधिक लाभदायक समझा गया था ... कि ऐसे युवा मूर्ख और घमंडी तानाशाह को शासन नहीं करना चाहिए या शासन नहीं करना चाहिए उनके ऊपर; ...कि उसे किसी न किसी तरह से टाल दिया जाए; और जो कोई काम हाथ में ले या करे, वे उसकी रक्षा करें।" डार्नली को अपनी सुरक्षा का डर था, और क्रिसमस से कुछ समय पहले स्टर्लिंग में अपने बेटे के बपतिस्मा के बाद वह अपने पिता की संपत्ति पर रहने के लिए ग्लासगो चला गया। यात्रा की शुरुआत में, वह बुखार, संभवतः चेचक, सिफलिस या जहर के परिणाम से पीड़ित था, और वह कुछ हफ्तों तक बीमार रहा। जनवरी 1567 के अंत में, मैरी ने अपने पति को एडिनबर्ग लौटने के लिए प्रेरित किया। वह शहर की दीवार के ठीक भीतर, किर्क ओ' फील्ड के पूर्व मठ में सर जेम्स बालफोर के भाई के घर में अपनी बीमारी से उबर गए। मैरी प्रतिदिन उनसे मिलने जाती थी, जिससे यह प्रतीत होता था कि सुलह हो रही है। 9-10 फरवरी 1567 की रात को, मैरी शाम को अपने पति से मिलने गईं और फिर अपने घर के एक सदस्य, बास्टियन पेजेज़ के विवाह समारोह में शामिल हुईं। सुबह के शुरुआती घंटों में, एक विस्फोट ने किर्क ओ' फील्ड को तबाह कर दिया, और डार्नले को बगीचे में मृत पाया गया, जाहिर तौर पर उसका गला दबाया गया था। शरीर पर गला घोंटने या मारपीट के कोई स्पष्ट निशान नहीं थे। संदेह के दायरे में आने वालों में बोथवेल, मोरे, सचिव मैटलैंड, अर्ल ऑफ मॉर्टन और स्वयं मैरी शामिल थीं। एलिजाबेथ ने अफवाहों के बारे में मैरी को लिखा, "अगर मैं ऐसा नहीं करती तो मुझे एक वफादार चचेरी बहन या एक स्नेही मित्र का पद नहीं निभाना चाहिए... आपको बता दूं कि पूरी दुनिया क्या सोच रही है। पुरुष कहते हैं कि, हत्यारों को पकड़ने के बजाय, आप जब वे बच रहे हों तो अपनी उँगलियाँ देख रहे हैं; ताकि आप उन लोगों से बदला न लें जिन्होंने आपको इतना आनंद दिया है, जैसे कि यह काम कभी नहीं हुआ होगा यदि इसके कर्ताओं को दण्ड से मुक्ति का आश्वासन नहीं दिया गया था। अपने लिए, मैं विनती करता हूँ आप विश्वास करें कि मैं ऐसा विचार नहीं रखूंगा।" फरवरी के अंत तक, बोथवेल को आम तौर पर डार्नले की हत्या का दोषी माना जाता था। डार्नली के पिता लेनोक्स ने मांग की कि बोथवेल पर संसद की संपत्ति के समक्ष मुकदमा चलाया जाए, जिस पर मैरी सहमत हो गईं, लेकिन सबूत इकट्ठा करने में देरी के लिए लेनोक्स के अनुरोध को अस्वीकार कर दिया गया। लेनोक्स की अनुपस्थिति में, और कोई सबूत प्रस्तुत नहीं किए जाने पर, 12 अप्रैल को सात घंटे की सुनवाई के बाद बोथवेल को बरी कर दिया गया। एक हफ्ते बाद, बोथवेल दो दर्जन से अधिक लॉर्ड्स और बिशपों को आइंस्ली टैवर्न बॉन्ड पर हस्ताक्षर करने के लिए मनाने में कामयाब रहे, जिसमें वे रानी से शादी करने के उसके उद्देश्य का समर्थन करने के लिए सहमत हुए।
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डार्नली द्वारा मैरी के बेटे, जेम्स का जन्म 19 जून 1566 को एडिनबर्ग कैसल में हुआ था, लेकिन रिज़ियो की हत्या के कारण अनिवार्य रूप से उसकी शादी टूट गई। अक्टूबर 1566 में, स्कॉटिश बॉर्डर के जेडबर्ग में रहने के दौरान, मैरी ने हर्मिटेज कैसल में अर्ल ऑफ बोथवेल से मिलने के लिए प्रत्येक रास्ते पर कम से कम चार घंटे की घोड़े पर यात्रा की, जहां वह सीमा नदियों के साथ झड़प में लगे घावों से बीमार पड़ गए थे। इस सवारी को बाद में मैरी के दुश्मनों द्वारा सबूत के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि दोनों प्रेमी थे, हालांकि उस समय कोई संदेह व्यक्त नहीं किया गया था और मैरी के साथ उसके पार्षद और गार्ड भी थे। जेडबर्ग लौटने के तुरंत बाद, उन्हें एक गंभीर बीमारी का सामना करना पड़ा जिसमें लगातार उल्टी, दृष्टि की हानि, भाषण की हानि, आक्षेप और बेहोशी की अवधि शामिल थी। ऐसा माना जाता था कि वह मृत्यु के निकट है या मर रही है। 25 अक्टूबर के बाद उनकी रिकवरी का श्रेय उनके फ्रांसीसी चिकित्सकों के कौशल को दिया गया। उसकी बीमारी का कारण अज्ञात है; निदान में शारीरिक थकावट और मानसिक तनाव, गैस्ट्रिक अल्सर से रक्तस्राव और पोरफाइरिया शामिल हैं। नवंबर 1566 के अंत में, एडिनबर्ग के पास क्रेगमिलर कैसल में, मैरी और प्रमुख रईसों ने "डार्नली की समस्या" पर चर्चा करने के लिए एक बैठक की। तलाक पर चर्चा की गई थी, लेकिन डार्नली को अन्य तरीकों से हटाने के लिए संभवतः उपस्थित राजाओं के बीच एक बंधन की शपथ ली गई थी: "यह सामान्य धन के लिए समीचीन और सबसे अधिक लाभदायक समझा गया था ... कि ऐसे युवा मूर्ख और घमंडी तानाशाह को शासन नहीं करना चाहिए या शासन नहीं करना चाहिए उनके ऊपर; ...कि उसे किसी न किसी तरह से टाल दिया जाए; और जो कोई काम हाथ में ले या करे, वे उसकी रक्षा करें।" डार्नली को अपनी सुरक्षा का डर था, और क्रिसमस से कुछ समय पहले स्टर्लिंग में अपने बेटे के बपतिस्मा के बाद वह अपने पिता की संपत्ति पर रहने के लिए ग्लासगो चला गया। यात्रा की शुरुआत में, वह बुखार, संभवतः चेचक, सिफलिस या जहर के परिणाम से पीड़ित था, और वह कुछ हफ्तों तक बीमार रहा। जनवरी 1567 के अंत में, मैरी ने अपने पति को एडिनबर्ग लौटने के लिए प्रेरित किया। वह शहर की दीवार के ठीक भीतर, किर्क ओ' फील्ड के पूर्व मठ में सर जेम्स बालफोर के भाई के घर में अपनी बीमारी से उबर गए। मैरी प्रतिदिन उनसे मिलने जाती थी, जिससे यह प्रतीत होता था कि सुलह हो रही है। 9-10 फरवरी 1567 की रात को, मैरी शाम को अपने पति से मिलने गईं और फिर अपने घर के एक सदस्य, बास्टियन पेजेज़ के विवाह समारोह में शामिल हुईं। सुबह के शुरुआती घंटों में, एक विस्फोट ने किर्क ओ' फील्ड को तबाह कर दिया, और डार्नले को बगीचे में मृत पाया गया, जाहिर तौर पर उसका गला दबाया गया था। शरीर पर गला घोंटने या मारपीट के कोई स्पष्ट निशान नहीं थे। संदेह के दायरे में आने वालों में बोथवेल, मोरे, सचिव मैटलैंड, अर्ल ऑफ मॉर्टन और स्वयं मैरी शामिल थीं। एलिजाबेथ ने अफवाहों के बारे में मैरी को लिखा, "अगर मैं ऐसा नहीं करती तो मुझे एक वफादार चचेरी बहन या एक स्नेही मित्र का पद नहीं निभाना चाहिए... आपको बता दूं कि पूरी दुनिया क्या सोच रही है। पुरुष कहते हैं कि, हत्यारों को पकड़ने के बजाय, आप जब वे बच रहे हों तो अपनी उँगलियाँ देख रहे हैं; ताकि आप उन लोगों से बदला न लें जिन्होंने आपको इतना आनंद दिया है, जैसे कि यह काम कभी नहीं हुआ होगा यदि इसके कर्ताओं को दण्ड से मुक्ति का आश्वासन नहीं दिया गया था। अपने लिए, मैं विनती करता हूँ आप विश्वास करें कि मैं ऐसा विचार नहीं रखूंगा।" फरवरी के अंत तक, बोथवेल को आम तौर पर डार्नले की हत्या का दोषी माना जाता था। डार्नली के पिता लेनोक्स ने मांग की कि बोथवेल पर संसद की संपत्ति के समक्ष मुकदमा चलाया जाए, जिस पर मैरी सहमत हो गईं, लेकिन सबूत इकट्ठा करने में देरी के लिए लेनोक्स के अनुरोध को अस्वीकार कर दिया गया। लेनोक्स की अनुपस्थिति में, और कोई सबूत प्रस्तुत नहीं किए जाने पर, 12 अप्रैल को सात घंटे की सुनवाई के बाद बोथवेल को बरी कर दिया गया। एक हफ्ते बाद, बोथवेल दो दर्जन से अधिक लॉर्ड्स और बिशपों को आइंस्ली टैवर्न बॉन्ड पर हस्ताक्षर करने के लिए मनाने में कामयाब रहे, जिसमें वे रानी से शादी करने के उसके उद्देश्य का समर्थन करने के लिए सहमत हुए।