A 549 세포 를 5 % CO 2 함유 대기 에서 37 ℃ 에서 L - 글루타민 ( 2 mM ) , HEPES ( 25 mM ) , 및 10 % 열 - 불 활성 화 된 FBS ( Invitrogen Life Technologies ) , 100 U / ml 페니실린 , 및 100 ng / ml 스트렙토마이신 ( Life Technologies - BRL , Gaithersburg , MD ) 를 함유 한 Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium ( JBI Life Technologies , Inc . ) 에서 배양 하 였 다 . 트랜스펙션 1 일 전 에 , 5 x 105 세포 를 항생제 없이 2 ml 로 웰 ( well ) 당 시 딩 ( seeding ) 하 여 트랜스펙션 시 에 90 내지 95 % 의 컨 플루언스 ( confluence ) 를 수득 하 였 다 . 그런 다음 , A 549 세포 를 혈청 없이 OptMEM ( GIBCO BRL ) 에서 LF 2000 ( Invitrogen Life Technologies , 권장 DNA ㎍ : 리포 펙 타민 ( lipofectamine ) ㎖ = 1 : 2 ) 을 사용 하 여 CD 40 의 pGL 3 - 프로모터 로 임시 트랜스펙션 시켰 다 . 1 ㎍ 의 pSV - β - galactosidase control vector ( Promega ) 를 공동 - 트랜스펙션 시켜 트랜스펙션 효율 을 정상 화 하 였 다 . 트랜스펙션 한 지 48 시간 후 에 , 배양 된 세포 를 PBS 로 2 회 세척 하 고 리포터 용해 완충액 ( Promega ) 400 ㎕ 를 사용 하 여 스 크 래핑 ( scraping ) 함 으로써 용해 시켰 다 . 세포 를 마이크 로 튜브 로 옮겨 원심 분리 ( 400 ㅧ g , 5 분 , 상온 ) 하 고 상층 액 을 - 70 ℃ 에 저장 하 였 다 . β - 갈 락 토시 다제 활성 을 β - Galactosidase Enzyme Assay System Kit ( Promega ) 를 사용 하 여 오르 쏘 - 니트 로 페닐 - D - 갈 락 토피 라 노 시드 ( ortho - nitrophenyl - D - galactopyranoside , ONPG ) 가수 분해 에 의해 평가 하 였 고 , 전체 단백질 을 BCA protein assay kit ( Pierce ) 를 사용 하 여 측정 하 였 다 . 루시퍼 라 제 활성 을 Luciferase Assay System ( Promega ) 및 루미 노 미터 ( luminometer ) ( PerkinElmer , Turku , Finland ) 를 사용 하 여 측정 하 였 다 . 상대 적 인 루시퍼 라 제 활 성 을 pGL 3 - basic null vector 의 루시퍼 라 제 활성 에 대한 각 작 제물 들 의 루시퍼 라 제 활성 의 비 로써 결정 하 였 다 .