플라스미드 pTrcHis 2 AUpperPathway 를 제한 엔 도 뉴클레아제 SspI 로 소화 시켜 pTrc - mvaE - mvaS -( His 표지 ) - 터미네이터 를 함유 하 는 절편 을 방출 시켰 다 . 상기 절편 에서 , his - 표지 는 번역 되 지 않 았 다 . Qiagen Gel Purification 키트 를 사용 하 여 , 상기 무딘 말단 4 . 5 kbp 절편 을 1 . 2 % E - 겔 에서 정제 하 였 다 . 제한 엔 도 뉴클레아제 PvuII 로 벡터 를 소화 시키 고 , SAP 로 처리 하 고 , Qiagen Gel Purification 키트 를 사용 하 여 1 . 2 % E - 겔 로부터 겔 정제 하 여 pCL 1920 으로부터 의 탈 인산화 된 , 무딘 말단 4 . 2 kbp 절편 을 제조 하 였 다 . Roche Quick Ligation 키트 를 사용 하 여 두 절편 을 라 이게 이 션 하 고 , TOP 10 화학 적 수용성 세포 에 형질 전환 시켰 다 . 형질전환 체 를 스펙 티노 마이신 ( 50 ㎍/㎖) 함유 LA 상 에서 선별 하 였 다 . PCR 에 의해 , 삽 입물 의 존재 에 대해 스크리닝 하 여 올바른 콜로니 를 확인 하 였 다 . 플라스미드 를 pCL PtrcUpperPathway 로 지정 하 였 다 ( 도 26 및 27 ) .