2016 년 10 월 27 일 에 출원 된 PCT 국제 출원 제 PCT / US 2016 / 059078 호 에서 이전 에 기술 된 바 와 같이 , 플라스미드 pBLComK 를 사용 해 세포 를 유능 하 게 만들 었 다 ( 도 4 ) . 30 mg / l 의 카나마이신 이 포함 된 루리아 한천 ( Luria agar ) 상 에 세포 를 플 레이팅 하 고 37 ℃ 에서 밤새 배양 하 였 다 . 형성 된 콜로니 를 신선 한 루리아 한 천 상 에 다시 도말 하 고 37 ℃ 에서 밤새 배양 하 였 다 . 단일 콜로니 들 을 선발 하 고 42 ℃ 에서 루리아 액체 배지 ( Luria broth ) 내 에서 , 게놈 으로 의 통합 을 촉진 하 기 위해 밤새 진탕 배양 하 였 다 . 후속 하 여 , 30 mg / l 의 카나마이신 이 포함 된 루리아 한 천 상 에 세포 를 플 레이팅 하 고 37 ℃ 에서 밤새 배양 하 였 다 . 프라이머 369 및 384 를 사용 해 PCR 에 의해 게놈 으로 의 통합 을 확인 한 후 , 정확 한 클론 을 37 ℃ 에서 루리아 액체 배지 내 에서 밤새 배양 한 다음 , 루리아 한 천 상 에 플 레이팅 하 였 다 . 단일 콜로니 들 을 30 mg / l 의 카나마이신 이 포함 된 LB 한 천 플레이트 상 에 다시 도말 하 고 , 37 ℃ 에서 밤새 배양 하 여 게놈 으로부터 벡터 부분 이 제거 되 었 음 을 이중 교차 이벤트 ( double crossover event ) 에 의해 확인 하 였 다 . 카나마이신 이 존재 하 면 성장 할 수 없 는 콜로니 들 은 프라이머 752 및 753 ( 표 2 ) 를 사용 하 여 PCR 처리 하 고 , 수득 된 단편 을 시퀀싱 하 였 다 . 이 를 통해 rghR 2 유전자 에서 18 - bp 중복 이 제거 되 었 음 을 확인 하 였 다 .