재조합 인간 pro - MMP - 2 를 Prof . Gillian Murphy ( Department of Oncology , University of Cambridge , UK ) 에 의해 공급 되 었 고 , 한편 pro - MMP - 13 및 pro - MMP - 14 를 Calbiochem 으로부터 구입 하 였 다 . 전효소 ( proenzyme ) 를 사용 직전 에 p - 아미노 페닐 머 큐 릭 아세테이트 ( APMA : pro - MMP - 2 에 대해 37 ℃ 에서 1 시간 동안 2 mM 및 pro - MMP - 13 에 대해 37 ℃ 에서 30 분 동안 1 mM ) 로 활성 화 하 였 다 . Pro - MMP - 14 를 15 분 동안 37 ℃ 에서 트립신 5 μ g / ml 로 활성 화 하 고 이어서 대두 트립신 억제제 ( SBTI ) 23 μ g / ml 를 가하 였 다 . 분석 측정 을 위해 , 억제제 저장 용액 ( DMSO , 100 mM ) 을 형광 측정 분석 완충제 ( FAB : Tris 50 mM , pH = 7 . 5 , NaCl 150 mM , CaCl 2 10 mM , Brij 35 0 . 05 % 및 DMSO 1 %) 에서 각 MMP 에 대해 7 개 의 다른 농도 ( 0 . 01 nM - 100 μ M ) 로 추가 로 희석 하 였 다 . 활성 화 된 효소 ( 최종 농도 MMP - 2 에 대해 2 . 9 nM , MMP - 14 에 대해 1 nM , MMP - 13 에 대해 0 . 33 nM ) 및 억제제 용액 을 4 시간 동안 25 ℃ 에서 분석 완충제 중 에서 인 큐 베 이 팅 하 였 다 . DMSO ( 최종 농도 2 μ M ) 중 의 모든 효소 에 대한 형광 발생 기질 Mca - Lys - Pro - Leu - Gly - Leu - Dpa - Ala - Arg - NH 2 ( Bachem ) ( 참고 문헌 으로 , Neumann , U . ; Kubota , H . ; Frei , K . ; Ganu , V . ; Leppert , D . Anal . Biochem . 2004 , 328 , 166 참조 ) 의 200 μ M 용액 의 첨가 후 , 가수 분해 를 Molecular Device SpectraMax Gemini XS 플레이트 판독기 를 사용 하 여 형광 의 증가 를 기록 하 면서 ( λ ex = 325 nm , λ em = 395 nm ) 20 분 동안 15 초 마다 모니터링 하 였 다 .