인산화 된 펩티드 기질 에 대한 항체 를 사용 하 여 인산화 된 펩티드 기질 형성 을 검출 함 으로써 IRAK 4 효소 ( 카르 나 바이오 사이언 시스 ( Carna Biosciences ) , 일본 고베 추 오구 ) 활성 을 측정 하 였 다 . 이것 은 STK 1 KinEASE 검정 에 기반 한 시간 - 분해 형광 공명 에너지 전달 ( TR - FRET ) 면역 검정 ( 시스 바이오 , 매사추세츠 주 베드포드 ) 이 다 . 프록시 플레이트 - 384 플러스 플레이트 ( 퍼킨 엘머 , 매사추세츠주 월섬 ) 에서 수행 되 는 간단 한 2 - 단계 종점 검정 ( 5 μ l 효소 반응 에 이 은 5 μ l 정지 및 검출 용액 ) 으로서 검정 을 설계 하 였 다 . 비 - 선택 적 키나제 억제제 인 스타 우로스 포린 을 양성 대 조군 으로서 사용 하 였 다 . DMSO 중 에 희석 된 화합물 을 랩 사이트 ® 에코 550 액체 취급 시스템 을 사용 하 여 384 웰 플레이트 내 로 스폿 팅 한 후 , IRAK 4 효소 및 펩티드 기질 을 첨가 하 였 다 . 멀티 - 플로 ( 바이오 - 텍 인스 트루먼 츠 ( Bio - Tek Instruments ) ) 를 사용 하 여 반응 용액 을 전달 하 였 다 . 효소 및 펩티드 용액 을 실온 에서 15 분 동안 화합물 과 함께 인 큐 베이 션 한 후 , ATP 를 첨가 하 여 반응 을 개시 하 였 다 . 표준 5 μ l 반응 혼합물 은 반응 완충제 ( 50 mM HEPES , pH 7 . 0 , 0 . 02 % NaN 3 , 0 . 01 % BSA , 0 . 1 mM 오르토 바나 데이트 , 5 mM MgCl 2 , 0 . 025 % NP - 40 , 1 mM DTT ) 중 500 μ M ATP , 2 μ M 펩티드 ( STK 1 펩티드 ) , 0 . 75 nM 의 IRAK 4 를 함유 하 였 다 . 실온 에서 120 분 의 인 큐 베이 션 후 , 5 μ l 의 정지 및 검출 용액 ( 1 : 100 크 립 테이트 표지 된 항 - 인산화 펩티드 항체 용액 및 충분 한 EDTA 를 함유 하 는 50 mM HEPES pH 7 . 0 검출 완충제 중 125 nM 추적자 ) 을 첨가 하 였 다 . 이어서 플레이트 를 실온 에서 60 분 동안 추가 로 인 큐 베이 션 하 고 , 각각 340 nm / 615 nm / 665 nm 에서 의 여기 / 방출 / FRET 방출 로 엔 비전 2103 다중 표지 판독기 ( 퍼킨 엘머 ) 상 에서 판독 하 였 다 . 615 nm 및 665 nm 방출 파장 에서 의 형광 강도 를 비 ( 665 nm / 615 nm ) 로 표현 하 였 다 . 억제 백분율 을 하 기 와 같이 계산 하 였 다 :