인간 오렉신 - 1 ( hOX 1 ) 또는 인간 오렉신 - 2 ( hOX 2 ) 수용체 를 안정 적 으로 발현 하 는 차이니스 햄스터 난소 ( dHFr -) 돌연변이 세포주 를 , 글루 타 맥스 ( GlutaMax ; 상표명 ) 1 , 4 , 500 mg / ℓ D - 글루코스 및 나트륨 피 루 베이트 ( 카탈로그 번호 31966 - 021 ; 미국 캘리포니아주 칼스 버드 소재 인비 트로겐 ( Invitrogen ) , 5 % 투석 된 소 태아 혈청 ( 카탈로그 번호 . 26400 - 044 ) , 100 μ g / ㎖ 페니실린 및 100 μ g / ㎖ 스트렙토마이신 을 갖 는 둘 베코 개질 된 이 글 매질 ( Dulbecco ' s Modified Eagle Medium ) ( IX ) 에 유지 하 였 다 . 세포 를 폴리 - D - 리신 처리 된 , 96 - 웰 , 흑색 / 투명 - 바닥 플레이트 ( 카탈로그 번호 BD 356640 , 미국 캘리포니아주 팔 로 알토 소재 비디 바이오 사이언 시스 ( BD Biosciences ) 에 5 × 104 세포 / 웰 로 시 딩 하 였 다 . 24 시간 후 , 세포 를 1 시간 동안 37 ℃ 에서 FLIPR 완충액 ( 1 xHBSS , 20 mM HEPES , 2 . 5 mM 프로베네시드 ( Probenecid ) ) 중 의 4 μ M Flou - 4 아세 톡 시메 틸 에스터 ( 카탈로그 번호 F - 14202 , 미국 오리건주 유진 소재 몰리 큘러 프로브 스 ( Molecular Probes ) 로 적재 하 였 다 . 행크스 밸런스 트 솔트 솔 루 션 ( Hanks ' Balanced Salt Solution ; HBSS ) ( 10 X ) ( 카탈로그 번호 14065 - 049 ) 및 HEPES ( 1 M ) ( 카탈로그 번호 15630 - 056 ) 를 미국 캘리포니아주 칼스 버드 소재 의 인비 트로겐 으로부터 구입 하 였 다 . 프로베네시드 ( 250 mM ) ( 카탈로그 번호 P 8761 ) 는 스위스 부흐 스 소재 시그마 에서 입수 하 였 다 . 세포 를 FLIPR 완충액 으로 5 회 세척 하 여 과량 의 염료 를 제거 하 고 세포 간 칼슘 이동 [ Ca 2 +] i 를 , 전술 한 대로 플 루 오 로 메트 릭 이미 징 플레이트 리더 ( Fluorometric Imaging Plate Reader ; FLIPR - 96 , 미국 캘리포니아주 멘 로 파크 소재 몰리 큘러 디바 이시스 ( Molecular Devices ) 로 측정 하 였 다 ( 문헌 [ Malherbe et ah , Mol . Pharmacol , 64 , 823 - 832 , 2003 ] ) . 오렉신 A ( 카탈로그 번호 1455 , 영국 브리스톨 소재 토리 스 쿡 손 리 미티 드 ( Toris Cookson Ltd ) ) 를 작용 제 로서 사용 하 였 다 . 오렉신 A ( DMSO 중 의 50 mM 저장 용액 ) 를 FLIPR 완충액 + 0 . 1 % BSA 에 희석 시켰 다 . 오렉신 A 의 EC 50 및 EC 80 값 을 CHO ( dHFr -)- OX 1 R 및 - OX 2 R 세포주 에서 의 표준 작용 제 농도 - 응답 곡선 으로부터 매일 측정 하 였 다 . 모든 화합물 을 100 % DMSO 에 용해 시켰 다 . 11 개 농도 ( 0 . 0001 내지 10 μ M ) 의 억제 성 화합물 의 첨가 및 작용 제 로서 오렉신 - A 의 EC 80 값 ( 매일 측정 된 , 최대 작용 제 응답 의 80 % 를 나타내 는 농도 ) 을 이용 하 여 억제 곡선 을 결정 하 였 다 . 작용 제 를 적용 하 기 전 에 길항제 를 25 분 적용 하 였 다 ( 37 ℃ 에서 항온 처리 ( incubation ) ) . 응답 은 오렉신 - A 또는 오렉신 - B 의 EC 80 값 에 의해 유도 된 최대 자극 효과 로 정규 화 된 기초 마이너스 형광 에서 의 피크 증가 로서 측정 된다 . 억제 곡선 을 힐 ( Hill ) 등식 : y = 100 / ( 1 +( x / IC 50 ) nH ) ( 이때 , nH = 엑셀 피 트 ( Excel - fit ) 4 소프트웨어 ( 마이크 로 소프트 ) 를 사용 한 경사 인자 이 다 ) 에 따라 맞추 었 다 .