효모 로부터 플라스미드 DNA 의 회수 . 효모 로부터 돌연변이체 Cas 9 플라스미드 를 단리 하 기 위해 , 단일 콜로니 를 류신 이 없 는 5 mL 의 SD 배지 ( SDl ) 에서 200 rpm 에서 진탕 하 면서 30 ℃ 에서 밤새 성장 시켜 p 415 - GalL - Cas 9 - CYC 1 t 플라스미드 의 존재 에 대해 선택 하 면서 , 가이드 RNA 플라스미드 에 대한 선택 을 완화 시켜 그 의 희석 및 소실 을 유도 하 였 다 . 다음 날 , 세포 를 5000 xg 에서 5 분 동안 원심 분리 에 의해 수확 하 고 , 0 . 1 mg / ml 의 RNase A 를 함유 하 는 250 μ l 의 완충제 A 1 ( 뉴 클레오 스핀 플라스미드 ( Nucleospin Plasmid ) , 마슈 레 - 나겔 ( Macherey - Nagel ) ) 에 재현 탁 시켰 다 . 그 후 , 100 μ L 의 산 - 세척 된 유리 비드 ( 시그마 - 알드리치 ) 를 첨가 함 으로써 및 5 분 동안 연속 적 으로 볼 텍 싱 함 으로써 세포 를 기계 적 으로 용해 시켰 다 . 그 후 , 플라스미드 DNA 를 표준 미 니 프 렙 실리카 컬럼 을 제조자 의 지침서 에 따라 사용 하 여 상청 액 으로부터 회수 하 였 다 . DNA 를 30 μ L 의 10 mM 트리스 HCl pH 8 . 5 에서 용리 시켰 다 . 또한 암피실린 저항성 을 통해 선택 가능 한 후자 의 플라스미드 로부터 오염물 을 회피 하 기 위해 , 용리 된 DNA 를 NcoI 및 NheI 효소 ( 뉴 잉글랜드 바이오 랩스 ( New England BioLabs ) ) 로 소화 시켜 sgRNA 벡터 를 제거 하 였 다 . 소화 후 , 10 μ L 를 화학 적 으로 적격 인 이 . 콜라 이 ( E . coli ) 에서 형질 전환 시켰 다 . 그 후 , 회수 된 플라스미드 를 소화 시켜 그 들 의 동일 성 을 확인 한 후 , 생어 시퀀싱 하 여 Rec 1 - II 도메인 에 도입 된 돌연변이 를 확인 하 였 다 .