10 % FBS 및 1 μ g / mL 인슐린 ( 시그마 ) 이 보충 된 MEM 에서 배양 한 MCF - 7 세포 를 세정 하 고 , 작 은 부피 의 FACSmax 세포 해리 완충제 ( 젠 란티스 ( Genlantis ) ) 에 수집 한 후 에 5 mL 의 FACS 완충제 ( PBS / 1 % FBS / 0 . 1 % 나트륨 아지드 ) 를 첨가 하 였 다 . 세포 밀도 를 계수 하 고 , 1 x 106 개 세포 / mL 의 최종 농도 로 조정 하 였 다 . 100 μ l 의 세포 현탁액 을 96 - 웰 플레이트 의 각 웰 에 첨가 하 고 , 세포 를 원심 분리 ( 220 g , 3 분 , 4 ℃) 를 통해 펠릿 화 하 였 다 . 세포 펠릿 을 FACS 완충제 에 희석 된 적절 한 시험 항체 ( 전형 적 인 최종 항체 농도 는 100 내지 0 . 1 nM 임 ) 100 μ L 에 재현 탁 시키 고 , 플레이트 를 얼음 상 에서 45 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 리간드 차단 항체 MAB 3481 ( R & D 시스템즈 ) 를 양성 대 조군 으로 포함 시켰 다 . 세포 를 염색 완충제 로 2 회 세척 한 후 에 FACS 완충제 에 희석 된 10 nM NRG 1 - β 1 EGF 도메인 ( R & D 시스템즈 ) 을 첨가 하 고 , 얼음 상 에서 45 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 세포 를 염색 완충제 로 2 회 세척 하 고 , 결합 된 뉴 레 귤 린을 10 nM 항 - 인간 NRG 1 - β 1 EGF 도메인 항체 ( R & D 시스템즈 ) 와 세포 를 얼음 상 에서 45 분 동안 인 큐 베이 션 하 여 검출 하 였 다 . 세포 를 염색 완충제 로 2 회 세척 하 고 , FACS 완충제 로 1 / 500 희석 된 PE - 연결 된 항 - 염소 항체 ( 잭슨 이 뮤 노리 서치 ) 와 얼음 상 에서 45 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 세포 를 원심 분리 를 통해 펠릿 화 하 고 , 펠릿 을 200 μ L FACS 완충제 에 재현 탁 시켰 다 . 각각 의 샘플 을 정량 화 하 기 위해 10 , 000 개 의 살 아 있 는 세포 를 LSR II 유동 세포 측정기 ( BD 바이오 사이언 시즈 ) 상 에서 계수 하 고 , 세포 표면 결합 된 뉴 레 귤 린 의 양 을 평균 채널 형광 을 측정 하 여 평가 하 였 다 .