완전 배지 에서 성장 시킨 준 - 전면 성장 SK - Br - 3 및 BT - 474 세포 를 아쿠 타제 ( PAA 래 보 러 토리 즈 ) 로 수확 하 고 , 적절 한 성장 배지 에 5 x 105 개 세포 / mL 의 최종 농도 로 재현 탁 시켰 다 . 이어서 , 100 μ L 의 세포 현탁액 을 96 - 웰 편평 바닥 플레이트 ( 눈 크 ) 의 각각 의 웰 에 첨가 하 여 5 x 104 개 세포 / 웰 의 최종 밀도 를 생성 하 였 다 . 이어서 , 모든 플레이트 를 37 ℃ 에서 밤새 인 큐 베이 션 한 후 에 적절 한 농도 의 HER 3 항체 ( 적절 한 배지 에 희석 됨 ) 로 80 분 동안 37 ℃ 에서 처리 하 였 다 . 모든 배지 를 부드럽 게 흡인 하 고 , 세포 를 1 mM CaCl 2 및 0 . 5 mM MgCl 2 ( 깁 코 ) 를 함유 하 는 빙 냉 PBS 로 세척 하 였 다 . 50 μ L 빙 냉 용해 완충제 ( 20 mM 트리스 ( pH 8 . 0 ) / 137 mM NaCl / 10 % 글리세롤 / 2 mM EDTA / 1 % NP - 40 / 1 mM 나트륨 오르토 바나 데이트 / 아 프로 티 닌 ( 10 μ g / mL ) / 류 펩 틴 ( 10 μ g / mL ) ) 를 첨가 하 여 세포 를 용해 시키 고 , 얼음 상 에서 진탕 시키 면서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 용해 물 을 수집 하 고 , 1800 g 에서 15 분 동안 4 ℃ 에서 회전 시켜 세포 잔해 를 제거 하 였 다 . 20 μ L 의 용해 물 을 3 % BSA / 1 x 트리스 / 0 . 1 % 트윈 - 20 으로 이전 에 차단 시킨 멀티 - 스팟 384 - 웰 포스 포 - Akt 탄소 플레이트 ( 메조 스케일 디스커버리 ) 에 첨가 하 였 다 . 플레이트 를 진탕 시키 면서 2 시간 동안 실온 에서 인 큐 베이 션 한 후 에 용해 물 을 흡인 하 고 , 웰 을 1 x 트리스 완충제 ( 메조 스케일 디스커버리 ) / 0 . 1 % 트윈 - 20 으로 4 회 세척 하 였 다 . 인산화 Akt 를 진탕 시키 면서 실온 에서 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 여 1 % BSA / 1 x 트리스 / 0 . 1 % 트윈 - 20 에 50 배 희석 된 술포 - 태그 항 - 포스 포 - Akt ( S 473 ) 항체 ( 메조 스케일 디스커버리 ) 20 μ L 를 이용 하 여 검출 하 였 다 . 웰 을 1 x 트리스 / 0 . 1 % 트윈 - 20 으로 4 회 세척 한 후 에 20 μ L 의 판독 완충제 T ( 계면 활성제 포함 ) ( 메조 스케일 디스커버리 ) 를 첨가 하 고 , 메조 스케일 섹터 이미 저 를 이용 하 여 신호 를 정량 화 하 였 다 . 항체 MOR 06391 또는 MOR 03207 을 이 소형 대 조군 으로 신호 전달 실험 에 포함 시켰 다 .