레바 우디 오시드 A 에 대한 조작 된 라운드 15 변이체 의 활성 을 특성 화 하 기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험 을 수행 하 였 다 . 0 . 006 - 0 . 2 g / L 수준 의 진탕 플라스크 분말 ( SFP ) 을 76 ℃ 에서 0 . 5 시간 동안 예비 인 큐 베이 팅 한 후 , 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 6 , 20 mM 레바 우디 오시드 A , 0 . 2 mM ADP , 50 mM 수크로스 , 및 0 . 1 g / L SUS SFP 서열 번호 2064 를 함유 하 는 100 μ L 의 총 반응 부피 에 첨가 하 였 다 . 반응 은 4 시간 동안 300 RPM 에서 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 예비 인 큐 베이 팅 된 SFP 와 함께 60 ℃ 에서 또는 예비 인 큐 베이 팅 을 거치 지 않 은 SFP 와 함께 55 ℃ 에서 수행 하 였 다 . 반응물 을 상기 한 바 와 같이 희석 하 고 , 켄 칭 하 고 , 분석 하 였 다 . 0 . 025 g / L SFP 로딩 시 에 라운드 15 변이체 에 의한 레바 우디 오시드 D 의 생성 수준 은 표 55 . 3 에 제시 된다 . 표 55 . 3 에 열거 된 9 개 의 변이체 중 5 개 는 두 조건 모두 하 에서 서열 번호 3956 보다 더 높 은 활성 을 가졌 다 . 돌연변이 P 73 A , K 143 P , I 144 V , V 179 D , E 186 G , K 187 T , K 373 R , 및 N 423 R ( 서열 번호 4256 ) 및 그 의 코딩 폴리뉴클레오티드 ( 서열 번호 4255 ) 를 갖 는 변이체 가 두 조건 모두 에서 가장 개선 되 었 고 , 레바 우디 오시드 A 의 글 루 코 실화 를 위한 추가 의 유도 진화 를 위해 선택 되 었 다 .