항체 OX 40 리간드 - OX 40 R 억제 분석법 : 항체 들 을 인간 - OX 40 리간드 ( L ) 를 발현 하 는 300 - 19 세포 가 OX 40 - 인간 IgG 1 융합 단백질 이 코팅 된 플레이트 에 결합 하 는 것 을 차단 하 는 능력 에 대해 테스트 하 였 다 . 300 - 19 - OX 40 L 세포주 를 10 ％ 송아지 태아 혈청 ( Hyclone ( Logan , UT ) ) , 10 mM HEPES , 1 ％ 페니실린 - 스트렙토마이신 , 2 mM L - 글루타민 , 0 . 1 mM 비 - 필수 아미노산 , 0 . 05 mM 2 - 메르 캅 토 에탄올 및 0 . 5 ㎎/㎖ 제 네 티 신 ( Geneticin ) ( Gibco ( Grand Island , NY ) ) 이 보충 된 RPMI 배지 ( Gibco ( Grand Island , NY ) ) 에서 성장 시켰 다 . OX 40 - 인간 IgG 1 융합 단백질 은 세 포외 OX 40 단백질 의 처음 220 개 의 아미노산 을 함유 한다 . 융합 단백질 을 코팅 완충제 ( BupH , 카르보 네이트 - 바이 카르보 네이트 완충제 , Pierce ( Rockford , IL ) ) 내의 100 μ / 웰 ( 5 ㎍/㎖) 로 Nunc 맥시 솝 플레이트 ( Nunc ( Roskilde , Denmark ) ) 상 에 코팅 하 고 , 하룻밤 동안 4 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 플레이트 를 종이 타월 상 에 블롯 팅 ( blotting ) 하 여 유체 를 제거 하 고 , 200 ㎕/ 웰 의 차단 완충제 ( PBS 에 희석 된 5 ％ 카네이션 밀크 ( Carnation Milk ) 로 차단 하 고 , RT 0 에서 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 PBS 로 세정 한 후 , PBS 내 에 희석 된 항체 의 다양 한 희 석물 을 분석 플레이트 에 첨가 하 고 ( 50 ㎕/ 웰 ) , RT 0 에서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 6 × 105 개 / 웰 의 PBS 내 의 세포 50 ㎕/ 웰 을 항체 를 함유 하 는 웰 에 첨가 하 고 , 추가 로 60 분 동안 37 ℃ 에서 5 ％ CO 2 습식 챔버 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 PBS 로 부드럽 게 2 회 세정 하 여 , 비 - 부착 세포 를 제거 하 고 , 200 ㎕ 의 20 ㎍/㎖ 플루오레세인 디아세테이트 ( Sigma ( St . Louis , MO ) ) PBS 용액 을 각각 의 웰 에 첨가 함 으로써 웰 내 의 세포 활성 을 측정 하 였 다 . 플레이트 를 37 ℃ 에서 5 ％ CO 2 습식 챔버 에서 90 분 동안 인 큐 베이 션 하 고 , 분광 광도계 ( Spectra Max 340 , Molecular Devices ( Sunnyvale , CA ) ) 를 사용 하 여 490 에서 판독 하 였 다 .