클로로퀸 저항성 열 대 열 말 라리아 원충 ( P . falciparum ) FCR - 3 을 게 노 믹 DNA 및 mRNA 추출 을 위해 사용 하 였 다 . 정 방향 ( 5 '- GGA TCC AAT GGG TAA GGA AAA AAC AC - 3 ', 서열 번호 2 ) 및 역방향 ( 5 '- CTC GAG TTT TTT GGC TGG TGC T - 3 ', 서열 번호 3 ) 프라이머 를 이용 하 여 전장 의 PfEF 1 - 1 α ( GenBank accession number : AVN 98121 . 1 ) 유전자 를 증폭 하 였 다 . PCR 은 CFX 96 Touch ™ Real - Time PCR Detection System ( Bio - Rad , USA ) 을 이용 하 였으며 , 반응 조건 은 하 기 와 같 다 : 95 ℃ 5 분 → [ 95 ℃ 30 초 → 56 ℃ 45 초 → 72 ℃ 1 분 ] ( 30 회 ) → 72 ℃ 5 분 . PCR 산물 은 pET 21 b + 벡터 ( Novagen , USA ) 에 클로닝 하 였으며 , 상기 재조합 벡터 를 대장균 BL 21 ( DE 3 ) 에 형질 전환 하 였 다 . 재조합 항원 의 발현 을 위하 여 , 상기 형질전환 대장균 을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린 을 포함 하 는 250 ㎖ 의 LB 액체 배지 에 접종 하 고 , 37 ℃ 에서 OD 600 값 이 0 . 5 ~ 0 . 6 이 될 때 까지 진탕 배양 하 였 다 . 그 후 , 0 . 5 mM 의 IPTG ( isopropyl β - d - 1 - thiogalactopyranoside ) 를 첨가 하 고 22 ℃ 에서 18 시간 배양 하 여 항원 단백질 의 발현 을 유도 하 였 다 . 그 후 , 15 , 941 xg , 4 ℃, 10 분 의 조건 으로 원심 분리 하 여 세포 펠릿 을 회수 하 고 결합 버퍼 ( 20 mM Tris - Cl , pH 7 . 5 , 300 mM NaCl , 25 mM imidazole ) 로 세척 한 후 원심 분리 하 여 세포 펠릿 을 재 회수 하 고 , 프로테아제 저해제 칵테일 ( complete ™ ULTRA Tablets , Roche , Germany ) 을 첨가 한 결합 버퍼 를 이용 하 여 재현 탁 시키 고 아이스 ( ice ) 에 15 분 간 두 었 다 . 27 , 237 xg , 4 ℃, 15 분 의 조건 으로 원심 분리 하 고 , His 6 태그 - 융합 된 EF - 1 α 단백질 의 정제 를 위해서 상층 액 을 NI - NTA 친화성 컬럼 ( Thermo - Fisher Scientific , USA ) 에 로딩 하 였 다 . 그 후 , 세 척 버퍼 ( 20 mM imidazole , 300 mM NaCl , 20 mM Tris - HCl , pH 7 . 5 ) 를 이용 하 여 세척 하 고 , 용출 버퍼 ( 250 mM imidazole , 300 mM NaCl , 20 mM Tris - Cl , pH 7 . 5 ) 를 사용 하 여 재조합 PfEF - 1 α ( 이하 , rPfEF - 1 α ) 를 용출 시켰 다 . 정제 된 rPfEF - 1 α 는 SDS - PAGE 겔 에 로딩 하 여 확인 하 였 다 .