IgG 1 - CONA - C 49 W 의 클리어런스 율 에 대한 E 430 G Fc - Fc - 증진 돌연변이 및 C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 의 효과 를 SCID 마우스 에서 의 PK 실험 에서 연구 하 였 다 . 모든 시험 된 항체 변이체 가 표 6 에 열거 되 어 있 다 . 동물 실험 을 법령 ( 2010 / 63 / EU ) 으로부터 번역 된 네덜란드 동물 보호법 ( WoD ) 및 적용 가능 한 경우 , " 문헌 [ Code of Practice "" animal experiments for cancer research "" ( Inspection V & W ", Zutphen , The Netherlands , 1999 ) ] 에 따라 수행 하 였으며 , 위트레흐트 윤리 위원회 에 의해 승인 받 았 다 . 동물 을 수용 하 고 , AAALAC 및 ISO 9001 : 2000 인증 동물 시설 ( GDL ) 에서 FELASA 에 의해 규정 된 바 와 같 은 우수 동물 관리 기준 에 따라 취급 하 였 다 . 11 - 12 주령 암컷 SCID 마우스 ( C . B - 17 / IcrHan ® Hsd - Prkdcscid ; 엔 비고 ( Envigo ) SCID 마우스 ) 에게 200 μ L 주사 부피 중 450 μ g 항체 ( 22 . 5 mg / kg ) 를 정맥 내 로 주사 하 였 다 ( 군당 3 마리 마우스 ) . 50 μ L 혈액 샘플 을 항체 투여 10 분 , 4 시간 , 1 일 , 2 일 , 7 일 , 14 일 및 20 일 후 에 복재 정맥 으로부터 수집 하 였 다 . 혈액 을 헤파린 - 함유 바이알 내 로 수집 하 고 , 14 , 000 g 에서 10 분 동안 원심 분리 하 였 다 . 20 μ L 혈장 샘플 을 380 μ L PBS 로 희석 하 고 ( 1 : 20 ) , 항체 농도 의 결정시 까지 - 20 ℃ 에서 저장 하 였 다 . 총 인간 IgG 농도 를 샌드위치 ELISA 를 사용 하 여 결정 하 였 다 . 마우스 항 - 인간 IgG - 카파 mAb 클론 MH 16 ( CLB 산 퀸 , 카탈로그 번호 M 1268 ) 을 포획 항체 로서 사용 하 고 , 100 μ L 로 4 ℃ 에서 밤새 96 - 웰 마이크로 론 ELISA 플레이트 ( 그 라이너 , 독일 ) 에 PBS 중 2 μ g / mL 의 농도 로 코팅 하 였 다 . 플레이트 진탕기 상 에서 0 . 2 % 소 혈청 알부민 ( BSA ) 이 보충 된 PBS 와 함께 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 함 으로써 플레이트 를 차단 하 였 다 . 세 척 후 , 100 μ L 의 희석 된 혈장 샘플 을 첨가 하 고 , 플레이트 진탕기 상 에서 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 300 μ L PBST ( 0 . 05 % 트윈 20 이 보충 된 PBS ) 로 3 회 세척 하 고 , 후속 적 으로 플레이트 진탕기 상 에서 100 μ L 퍼 옥시 다제 - 표지 된 염소 항 - 인간 IgG 이 뮤 노 글로불린 ( # 109 - 035 - 098 , 잭슨 ( Jackson ) , 펜 실베 니 아주 웨스트 그레이스 ; 0 . 2 % BSA 가 보충 된 PBST 중 1 : 10 . 000 ) 과 함께 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 다시 300 μ L PBST 로 3 회 세척 한 후 , 빛 으로부터 보호 된 100 μ L 기질 2 , 2 '- 아 지노 - 비스 ( 3 - 에틸 벤즈 티 아졸린 - 6 - 술폰산 ) [ ABTS ; 로슈 , 카탈로그 번호 11112 422001 ; 50 mL ABTS 완충제 ( 로슈 , 카탈로그 번호 11112 597001 ) 중 1 개 의 정제 ] 과 함께 실온 에서 15 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 100 μ L 2 % 옥살산 을 첨가 하 고 실온 에서 10 분 동안 인 큐 베이 션 함 으로써 반응 을 정지 시켰 다 . 흡광도 를 마이크 로 플레이트 판독기 ( 비 오텍 , 버몬트주 위 누스 키 ) 에서 405 nm 에서 측정 하 였 다 . 참조 곡선 으로서 주사 된 물질 을 사용 하 여 농도 를 계산 하 였 다 . 플레이트 대 조군 으로서 IgG 를 함유 하 는 인간 골수종 단백질 ( 더 바인딩 사이트 ( The binding site ) , 카탈로그 번호 BP 078 ) 을 포함 시켰 다 . 인간 IgG 농도 ( μ g / mL ) 를 플롯 팅 하 고 ( 도 20 A ) , 그래프 패드 프리즘 을 사용 하 여 곡선 하 면적 ( AUC ) 을 계산 하 였 다 . 마지막 혈액 샘플링 날 ( 제 21 일 ) 까지 의 클리어런스 율 을 식 D * 1 . 000 / AUC 에 의해 결정 하 였으며 , 여기 서 D 는 22 . 5 mg / kg 의 주사 용량 이 다 ( 도 20 B ) . E 430 G Fc - Fc - 증진 돌연변이 및 / 또는 C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 를 함유 하 는 모든 시험 된 IgG 1 - CONA - C - 49 W 변이체 는 WT IgG 1 과 대등 한 클리어런스 율 을 나타냈 다 ( 도 20 A , B ) . 결론 적 으로 , C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 , 예컨대 K 326 W / E 333 S 또는 K 326 A / E 333 A 의 도입 은 E 430 G Fc - Fc - 증진 돌연변이 를 함유 하 는 IgG 1 항체 , 예컨대 IgG 1 - CONA - C 49 W - K 326 W / E 333 S / E 430 G 및 IgG 1 - CONA - C 49 W - K 326 A / E 333 A / E 430 G 에서 의 클리어런스 율 에 유의 하 게 영향 을 미치 지 않 는다 .