Cas 9 와 가이드 RNA 리보 핵단백질 ( RNP ) 복합체 의 조립 , HSPC 의 제조 , 및 HSPC 내로 의 RNP 의 전기 천 공 . 단일 가이드 RNA ( sgRNA ) 를 사용 한 RNP 의 형성 을 위해 , 12 μ g 의 각각 의 sgRNA , 12 μ g 의 CAS 9 단백질 및 1 μ L 의 10 x CCE 완충제 ( 20 mM HEPES , 100 mM KCL , 5 mM MgCL 2 , 5 % 글리세롤 및 신선 하 게 첨가 된 1 mM DTT ) 를 10 ul 의 총 부피 에서 조합 하 고 , 그 후 에 37 ℃ 에서 5 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 없 음 / 대 조군 조건 의 경우 , sgRNA 보다 는 비 히 클 을 첨가 하 였 다 . P 3 완충제 + 보충 제 에서 의 세포 밀도 는 1 . 3 x 106 / mL 이 었 다 . 7 개 복제 전기 천공 을 GCR - 0067 을 사용 하 여 수행 하 고 , 전기 천공 - 후 에 세포 를 조합 하 였 다 . 없 음 / 대 조군 조건 의 경우 , 전기 천 공 또는 Cas 9 의 첨가 없이 , 세포 를 P 3 완충제 로부터 확장 배지 로 직접 옮겼 다 . RNP 복합체 를 이용 한 전기 천 공 후 , 유세포 분석 세포 소팅 전 에 부가 적 인 3 일 동안 세포 를 확장 시켰 다 .