하 기 를 인코딩 하 는 서열 : 성숙 한 야생 형 인간 트립 타제 베타 1 ( Ile 16 - Pro 246 키모트립시노겐 넘버링 , 서열 번호 : 97 ) 은 다면체 프로모터 및 gp 67 분비 신호 서열 뒤 에서 변형 된 pAcGP 67 A 벡터 에 클로닝 되 었 다 . 달리 명시 되 지 않 는 한 , 이 부문 에서 , 트립 타제 는 인간 트립 타제 베타 1 ( 또한 일 명 인간 트립 타제 b 1 ) 을 지칭 한다 . 작 제물 은 N - 말단 His 6 태그 , 엔 테 로 키나제 절단 부위 및 , 일부 작 제물 에 대하 여 , C - 말단 FLAG 태그 를 함유 한다 . 부위 지향 적 돌연변이 유발 은 트립 타제 돌연변이체 를 생성 하 기 위해 표준 QuikChange ™ 프로토콜 ( Stratagene ) 을 사용 하 여 수행 되 었 다 . 모든 작 제물 은 DNA 서열 분석 으로 확인 되 었 다 . 재조합 배 큘로바이러스는 표준 프로토콜 에 따라 Sf 9 세포 에서 BaculoGold ™ 시스템 ( BD Biosciences ) 를 사용 하 여 생성 되 었 다 . 트리코 플 루 시아니 세포 는 대 규모 단백질 생산 을 위하 여 감염 되 었 고 감염 48 시간 후 수확 되 었 다 . 수확 된 배지 는 1 mM NiCl 2 , 5 mM CaCl 2 및 20 mM Tris pH 8 로 보충 되 었 고 , 30 분 동안 진탕 되 었 고 , 그 다음 20 분 동안 8500 x g 로 원심 분리 되 어 세포 를 제거 하 였 고 배지 로부터 침전 시켰 다 . 상청 액 배지 는 니켈 - 니트릴로트리 아세트산 ( Ni - NTA ) 친화도 칼럼 상 의 장입 에 앞서 0 . 22 μ m 폴리에테르 설폰 ( PES ) 필터 를 통해 여과 되 었 다 . 인간 트립 타제 베타 1 은 CHO DP 12 포유동물 세포주 에서 일시 적 형질 감염 으로 또한 발현 되 었 다 . 세포 배양 배지 는 아래 기재 된 바 와 같이 Ni - NTA 친화 도 정제 와 함께 시작 하 는 동일 한 정제 를 거치 게 되 었 다 .