생성물 을 제한 엔 도 뉴클레아제 PstI / BamHI 으로 소화 시키 고 , PstI / BamHI 으로 소화 시킨 pJM 102 에 라 이게 이 션 하 였 다 ( Perego , M . 1993 . Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis , p . 615 - 624 . In A . L . Sonenshein , J . A . Hoch , and R . Losick ( ed . ) , Bacillus subtilis and other gram - positive bacteria : biochemistry , physiology , and molecular genetics . American Society for Microbiology , Washington , D . C . ). 라 이게 이 션 물 을 대장균 TOP 10 화학 적 수용성 세포 에 형질 전환 하 고 , 형질전환 체 를 카르 베니 실린 ( 50 ㎍/㎖) 함유 LA 상 에서 선별 하 였 다 . 올바른 플라스미드 를 서열 분석 으로 확인 하 고 , pJMUpperpathway 2 로 지정 하 였 다 ( 도 50 및 51 ) . 정제 된 플라스미드 DNA 를 바실 러스 서브 틸리스 aprEnprE Pxyl - comK 에 형질 전환 하 고 , 형질전환 체 를 클로람페니콜 ( 5 ㎍/㎖) 함유 L 한천 에서 선별 하 였 다 . 올바른 콜로니 를 선별 하 고 , 클로람페니콜 10 , 15 및 25 ㎍/㎖ 를 함유 하 는 L 한 천 상 에서 순차 적 으로 플 레이팅 하 여 상위 경로 를 함유 하 는 카세트 의 카피 수 를 증폭 시켰 다 .