개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 … ( Translated to Korean ) | JoVE Video 
 JoVE Neuroscience 개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 영상 
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 Abstract : 개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 영상 
 태아 의 척수 가 중추 신경 계 ( CNS ) 의의 연결 과 glial 세포 의 큰 백분율 을 야기 할 신경 전구 세포 를 사이클링 으로 구성 되 어 있 습니다 . 많이 는 분자 메커니즘 을 그 모양 과 척수 를 대해 알려진 의 연결 을 차별 화 1 , 2 을 유도 되 지만 , 우리 는 세포 행동 의 수준 에서 이러 한 초기 이벤트 의 깊 은 이해 가 부족 합니다 . 그 들 은 neurogenesis 를 받 아야 하 는 대로 실시간 으로 신경 progenitors 의 동작 을 연구 하 기 때문 에 중요 합니다 . 초기 배아 조직 의 과거 , 실시간 영상 으로 세포 / 조직 문화 의 생존 뿐 만 ​ 아니 라 형광 이미 징 의 phototoxic 효과 에 의해 제한 되 었 습니다 . 여기 소설 전직 의 생체 내 슬라이스 문화 프로토콜 과 넓 은 필드 형광 현미경 ( 그림 1 ) 를 이용 , 오랜 기간 에 대한 이미지 와 같 은 조직 에 대한 소설 분석 을 제시 . 이 접근 법 은 병아리 배아 s 의 장기간 시간 이 경과 모니터링 구현 높 은 공간 과 시간 적 해상도 pinal 코드 전구 세포 . 이 분석 은 유전자 활동 을 위한 세포 및 서브 셀룰러 행동 , 소설 의 개발 과 고도 로 민감 한 기자 의 관찰 이외 에 이미지 배아 조직 3 , 4 의 범위 에 수정 할 수 있 습니다 ( 예 : 노치 신호 5 ) 이 분석 을 하 게 신호 방법 을 이해 하 기 위한 강력 한 도구 는 배아 발달 동안 세포 의 행동 을 규정 합니다 . Protocol : 개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 영상 
 1 . 음식 준비 슬라이스 배양 에 사용 되 는 요리 ( WillCo 요리 ) ( 거점 으로 coverslip 에 ) 유리 바닥 입니다 . 이러 한 유리 바닥 을 더럽히 지 않 으 6 cm 조직 배양 접시 에 렌즈 티슈 에 표시 됩니다 . 실험 전날 , 폴리 - L - 라이신 코팅 유리 바닥 에 수 있 도록 상온 에서 5 분 용 유리 바닥 접시 와 부화 두 ML 0 . 1 % 폴리 - L - 라이신 솔루션 을 추가 합니다 . 폴리 - L - 라이신 솔루션 을 제거 하 고 deionised 물 에 세 번 헹굼 후 한때 70 % 에탄올 인치 하룻밤 건조 둡니다 . 요리 도 부드럽 게 30 ~ 45 초 위한 낮 은 전력 에서 전자 레인지 에 가열 하 여 건조 하 실 수 있 습니다 . 2 . 배아 Electroporation 37 알 을 품 어 ° C 에서 햄버거 - 해밀턴 ( HH ) 10 단계 ( ~ 36 시간 ) ( 또는 다른 원 하 는 단계 ) 로 변경 합니다 . 시작 은 유리 바늘 을 ( 우리 가 불타 는 / 브라운 모델 p 87 microcapillary 풀 러 사용 ) 준비 needl 의 팁 을 끊 다 전 에 전자 해부 현미경 미세 집게 를 사용 하 여 . 그것 이 DNA 솔루션 의 주입 을 막 는 정도 로 좁 은 신중 하 지 못한 상태 에서 바늘 의 끝 이 배아 피어스 에 충분 한 날카로운 있 어야 합니다 . 배아 의 양쪽 에 윈도우 계란 과 장소 전극 ( 5 mm 간격 ) 신경 튜브 로 - DNA 를 ( 빠른 녹색 의 소량 으로 물들 고 deionised 물 에 0 . 5 μ g / μ l ~ 0 . 025 ) 주사 . 현재 적용 - 펄스 사이 의 950 MS 와 12 - 17 V 를 세 번 , 50 ms 펄스 길이 를 . 우리 는 각각 의 세포 를 추적 할 수 있 도록 모자이크 표현 을 달성 하 기 위해 DNA 의 낮 은 농도 와 낮 은 electroporation 전압 을 사용 합니다 . cellotape 과 달걀 껍질 에 창문 을 커버 하고 는 밀폐 되 어 있 는지 확인 하 십시오 . 배아 는 37 3 ~ 4 시간 또는 하 룻 ​ 밤 동안 복구 할 수 있 도록 허용 ° C . 3 . 콜라겐 과 슬라이스 문화 매체 준비 깔끔히 전 에 시간 정도 콜라겐 믹스 와 슬라이스 문화 매체 를 준비 합니다 . 300 μ l t 까지 ype 한 콜라겐 100 μ l 0 . 1 % 초산 용액 100 μ l 5 X L 15 매체 를 추가 하 십시오 . 각 또한 후 에 철저 하 게 소용돌이 . 솔루션 은 노란색 켜 야 합니다 . 지금 15 - 20 μ l 7 . 5 % 나트륨 중탄산염 철저히 와동 를 추가 합니다 . 솔루션 은 약간 분홍색 이 되 었 을 텐데 이 필요 한 중 탄산 볼륨 이 다를 수 있 습니다 . 빙판 에 유지 하 고 매번 신선 하 다 . 10 ML neurobasal 매체 는 1 X 최종 농도 와 10 μ l Gentamicin 솔루션 으로 , B - 27 보충 및 Glutamax 을 추가 하 려면 . 37 ° C 배양기 에서 개최 매체 5 % CO 2 와 버퍼 . 그것 은 CO 2 와 평 형 수 있 도록 하 는 컨테이너 의 상단 은 자유 롭 게 둡니다 . 4 . 슬라이스 문화 난자 에서 배아 를 제거 하 고 L 15 중간 에 씻 는다 . 하단 sylgard 의 레이어 와 그 들 이 긴장 뻗 어 되 도록 주변 엑스트라 배아 세포막 을 통해 그 들 을 핀 으로 조직 배양 접시 에 있 는 장소 . 마이크 사용 roknife , 관심 영역 을 통해 슬라이스 배아 더 할 나위 없이 가능 한 . 척수 의 경우 조각 은 두께 1 - 2 somites 사이 여야 합니다 . 당신 이 그 들 을 손실 되 지 않 도록 다른 배아 를 썰 어 동안 배아 에 붙 어 슬라이스 를 남겨 주 세요 . 팁 중 ~ 1 mm 를 잘라 와 P 2 또는 p 10 이것 을 장착 하 여 200 μ l micropipette 팁 을 준비 합니다 . 이 단서 는 유리 바닥 접시 에 척수 의 조각 을 전송 하 는 데 사용 됩니다 . 10 μ l 팁 은 조각 을 데리 러 만큼 광범위 하 지 않 습니다 . 코트 이전 준비 1 μ l 콜라겐 믹스 를 pipetting 하 여 콜라겐 과 팁 의 내부 . L 15 매체 와 헹굼 후 1 - 2 분 동안 둡니다 합니다 . 이 팁 내부 를 지키 는 로부터 조직 을 방지 할 수 있 습니다 . microknife 를 사용 하 는 배아 에서 슬라이스 를 분리 하 고 200 μ l 제보 를 들으며 1 μ l 로 설정 P 2 또는 p 10 를 사용 하 여 요리 에서 제거 합니다 . 가능 한 한 작 은 매체 로 소요 될 보 십시오 . 폴리 - L - 라이신 코팅 요리 에 대한 이 의 소용돌이 콜라겐 믹스 와 드롭 5 - 8 μ l . Immediately 벌금 포 셉 한 켤레 와 장소 에 콜라겐 과 위치 로 배아 슬라이스 를 넣 어 . 조각 이 몇 군데 되 는 측면 이 coverslip 으로 플러시 되 도록 배치 해야 합니다 . 조직 coverslip 에 폴리 - L - 라이신 코팅 을 준 수 해야 합니다 . 당신 coverslip 에 몇 조각 을 가지 고 때 까지 이 단계 를 반복 합니다 . 우리 는 대개 한 접시 에 6 - 9 조각 을 넣 을 수 있 습니다 . 모든 조각 이 제자리 에 있 는 되 면 접시 를 커버 하 고 콜라겐 20 분 동안 설정 할 수 있 습니다 . 초기 배치 콜라겐 의 일부 는 이미 건조 하 기 시작 했 을 수 있 습니다 . 이것 이 취재 전 에 L 15 소량 을 추가 방지 합니다 . 한번 설정 조심 스럽 게 적어도 한 시간 동안 37 ° C 에서 5 % CO 2 에서 equilibrated 되 었 습니다 2 ml 슬라이스 문화 매체 를 추가 하 십시오 . 케어 는 coverslip 에서 콜라겐 을 이동 시키 다 하 지 않 도록 촬영 해야 합니다 . 37 ° / 5 % CO 2 배양기 에서 장소 와 조각 은 이미 징 전 에 적어도 3 시간 동안 복구 할 수 있 습니다 . perspex 상자 재치 에 는 습도 , 장소 요리 가 없 는 경우 한 구석 에 젖 은 티슈 중 하 비트 . 5 . 이미 징 배아 조각 우리 는 이미지 조각 으로 WeatherStation 환경 챔버 를 들으며 DeltaVision 코어 와이드 필드 현미경 을 사용 합니다 . 챔버 는 지속 적 으로 5 % CO 95 분 의 2 % 의 공기 에서 현미경 스테이지 를 유지 하 는 CO 2 관류 장치 와 37 ° C , 에서 관리 하 고 있 습니다 . 이미 징 은 보통 40 X / 1 . 30 NA 기름 침지 렌즈 를 사용 하 고 영상 이 CCD 카메라 를 냉각 CoolSnap HQ 2 으로 캡 처 되 어 수행 됩니다 . Z - 섹션 45 μ m 의 조직 을 통해 매년 1 . 5 μ m 의 를 점령 하 고 있 습니다 . 노출 시간 은 가능 한 한 낮 은 보관 해야 합니다 . 우리 는 일반 적 으로 각각 의 Z - 섹션 에 5 - 50 MS 에 대해 쉽 게 받 을 수 있 습니다 . 이미지 는 매 7 분 캡 처 되 어 최대 9 조각 이 함수 를 방문 DeltaVision 시스템 의 정확 한 지점 을 이용 하 여 방문 하 실 수 있 습니다 . 6 . 대표 결과 척수 의 전구 세포 의 예 를 촬영 된 시퀀스 는 그림 . 2 A 와 해당 영화 1 . 이미 징 은 이틀 짜리 ( HH 단계 12 ) ​ 배아 에서 척수 의 단면 에서 시작 되 었 습니다 . 이 세포 는 GFP - α Tubulin 을 표현 구조 로 transfected 되 었 다 . 이러 한 초기 개발 단계 동안 , 신경 전구 세포 는 주로 세포 가 두 개 의 추가 사이클링 전구 세포 를 생성 하 기 위해 분할 하 는 동안 시조 - 시조 모드 부문 을 받 고 있 다 . 그림 . 2 B 와 해당 동영상 2 세포막 을 마킹 , GFP - GPI ( GPI 는 GFP 를 정박 ) 로 transfected 세포 를 보여 줍니다 . 이 세포 는 기초 과정 을 둘 로 분할 하 고 똑같이 딸 세포 에 의해 상속 되 는 동안 부서 를 겪 습 . 1 그림 . 촬영 된 영상 을 위한 슬라이스 문화 프로토콜 . 그림 2 . 세포 B 정상 척수 개발 중 에 ehavior . 영화 1 ( ) 선택 된 프레임 . GFP - tubulin 을 표현 세포 는 다시 한 번 ( 24 H 23 분 25 H 54 분 ) 나누 어 두 딸 세포 를 생 성 , 혀 끝 의 표면 ( 2 H 20 분 ) 에 수직 이 다 절단 비행기 로 나눕니다 . ( b ) 는 영화 2 선택 된 프레임 . GFP - GPI 로 transfected 세포 는 기저 과정 이 분할 ( 흰색 화살표 ) 와 동등 딸 세포 에 의해 상속 되 는 동안 세포 분열 을 거쳐 . 영화 1 . 동영상 을 보 려면 여기 를 클릭 하 십시오 . 영화 2 . 동영상 을 보 려면 여기 를 클릭 하 십시오 . Discussion : 개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 영상 
 우리 는 닭 배아 슬라이스 문화 셀 동작 을 모니터링 하 려면 여기 를 소설 촬영 된 영상 분석 을 제시 . 24 - 48 시간 사이 의 시간 을 프레임 캡 처하 여 쉽 게 있 지만 , 이러 한 분석 은 70 시간 동안 살 아 있 는 조직 의 고해상도 이미 징 을 가능 하 게 합니다 . 높 은 NA 오일 객관 적 이 고 시간 지점 사이 에 상대 적 으로 짧 은 간격 의 사용 은 물론 우리 가 흔히 빠르 게 발생 셀 동작 을 모니터링 할 수 있 도록 로서 , 높 은 해상도 이미지 획득 을 가능 하 게 하 고 , 쉽 게 공 촛 점 를 사용 하 여 기존 촬영 된 영상 중 에 놓친 수 현미경 . 이 분석 의 주요 한 이점 은 오랜 기간 동안 이미지 셀 에 대한 능력 입니다 . 7 현미경 을 스캔 공 촛 점 레이저 대신 넓 은 필드 6 의 사용 은 이것 에 대한 중요 합니다 . 공 촛 점 현미경 은 전통 적 으로 광학 부분 을 직접 초점 정보 를 밖 으로 제거 하 는 기능 을 포함 하 여 넓 은 필드 현미경 을 통해 몇 가지 장점 을 제공 하 고 있 다 8 빛 의 손실 이 생깁니다 . 와이드 필드 현미경 는 반면 에 , 전체 현장 조명 을 사용 하 고 객관 적 통해 모든 빛 을 전달 은 검출기 로 전송 됩니다 . 높 은 양자 효율 이 결합 은 결합 소자 ( CCD ) 카메라 매우 빠른 노출 시간 으로 공 촛 점 현미경 9 에 비해 노이즈 비율 높 은 신호 이미 징 을 보장 을 냉각 . 우리 의 애플 리케 이 션 에서 우리 는 오랜 기간 , 기록 3 D 스택 궁극 적 으로 작 은 거의 회절 제한 적 인 구조 를 해결 하 기 위한 이미지 해야 합니다 . 공 촛 점 현미경 적 검출기 에 도달 밖 포커스 라이트 를 방지 하 기 때문 에 상당히 두께 , 밀도 - 라벨 샘플 7 , 8 의 배경 을 줄일 수 있 지만 , 그것 은 단지 보다 훨씬 더 큰 빛 을 입력 으로 사용 할 신호 대 잡음 비율 을 달성 와이드 필드 현미경 10 . 매우 가벼운 민감 한 sparsel 위한 우리 electroporated 척수 의 조각 같 은 당 - 라벨 샘플 따라서 와이드 필드 현미경 은 공 촛 점 현미경 보다 더 수행 합니다 . deconvolution 하 여 이미지 복원 과 결합 하 면 , 어느 초점 정보 를 밖 으로 제거 하 고 개선 명암 , 넓 은 필드 작 고 희미 한 물체 11 탐지 에 특히 좋 은 나서 입니다 . 에게 모든 조직 이미 징 실험 에 적합 하 지 않 지만 , 이러 한 방식 은 우리 의 라이브 세포 이미 징 애플 리케 이 션 을 위한 매우 효과 있 다 . 형광 단백질 의 선택 은 세포 생존 에 영향 을 미칠 수 있 는 중요 한 요소 이 다 . 우리 는 최상 의 결과 를 마커 로 녹색 형광 단백질 ( GFP ) 12 를 사용 하 는 구조 에서 얻 을 다는 것 을 찾 을 수 있 습니다 . 현재 효과 적 으로 듀얼 채널 건너 뛰 자 위한 GFP 와 함께 사용 할 수 있 는 적색 형광 단백질 의 범위 를 평가 하 고 있 습니다 . 13 사용 가능 한 이러 한 단백질 의 여러 가지 가 있 습니다 . 많 은 단백질 은 형광 단백질 로 fusions 로 안정 있 지만 일부 단백질 은 감소 세포 생존 능력 의 결과 로 , 융합 에 의한 불안 정한 렌더링 할 수 있 습니다 . 그러 한 경우 에 는 내부 ribosome 항목 사이트 ( IRES ) 을 포함 하 는 구성 요소 의 사용 은 형광 단백질 로부터 관심 단백질 을 분리 하 는 데 유용 합니다 . 언제 이미 징 척수 의 조각 , 주의 가 형광 등 에 노출 을 최소 화 하 기 위해 이동 해야 합니다 . 현미경 의 eyepieces 는 조각 을 찾 아 입장 하 는 전송 빛 ( brightfield ) 에서 만 사용 해야 합니다 . 형광 이미지 는 항상 최소한 의 노출 시간 을 이용 한 현미경 소프트웨어 를 사용 취득 해야 합니다 . 이 들 은 5 - 50 MS 의 범위 에 보관 해야 하 며 중성 밀도 필터 의 사용 으로 실험 한다 . 긴 노출 시간 이 처음 선명 한 이미지 를 생산 할 수 있 지만 , 형광 등 노출 phototoxic 효과 는 세포 사망 을 초래 할 수 있 습니다 . 이 지역 중 에 손상 되 었 을 수 있 습니다 티슈 가 들 어 있 으므로 coverslip 에 가장 가까운 조직 의 첫 번 째 5 - 10 μ m 의 가 몇 군데 하 지 말 아야 깔끔히 . 여기 에 제시 된 예제 는 HH 단계 10 과 나중 에 몇 군데 6 ~ 7 시간 에서 electroporated 배아 으로 하 지만 , 이 방법 은 스테이지 18 HH 하 는 배아 에 사용 할 수 있 습니다 . 나중 단계 에서 척수 조직 이 훨씬 더 크 네요 그래서 손 으로 썰 어 하 기 어렵 습니다 . 이러 한 경우 , 낮 은 용융 점 아가 로 오스 의 배아 를 내장 하 고 vibratome 와 sectioning 하 면 더 좋 은 결과 를 얻 을 수 있 습니다 . 우리 가 개발 척수 의 영상 전지 방법 으로 이러 한 분석 을 제시 하 더라도 , 이 접근 법 은 또한 감각 placodes 3 를 포함 해 이미지 를 다른 배아 조직 에 수정 되 었 습니다 . Disclosures : 개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 영상 
 관심 의 어떠 한 충돌 선언 없 습니다 . References : 개발 Neuroepithelium 의 세포 문제 의 고해상도 라이브 영상 
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