Output - 3 파지 라이브러리 를 희석 하 고 평판 배양 하 여 37 ℃ 에서 8 hr 동안 성장 시켰 고 22 ℃ 에서 밤새 도록 항 - 카파 항체 - 코팅 된 필터 로 캡쳐 하 였 다 . 비오티 닐 화 된 LAG - 3 - huFc ( 50 nM ) 및 NeutrAvidin - AP 컨 쥬 게이트 를 필터 에 적용 하 여 항원 결합 항 - LAG 3 파지 를 검출 하 였 다 . 양성 파지 플라크 를 선택 하 고 100 μ L 파지 용출 버퍼 로 용출 시켰 다 . 그 다음 에 파지 단일 지점 ELISA ( SPE ) 에 대한 고 - 역가 ( HT ) 파지 ( 테스트 된 각각 의 단백질 50 nM 로 코팅 된 ELISA 고정 된 기질 ) 를 제조 하 기 위해 용출 된 파지 약 10 - 15 μ L 를 사용 하 여 XL 1 - Blue 컴 피턴 트 ( competent ) 세포 1 mL 를 감염 시켰 다 . 각 파지 의 1 x 1010 개 의 플라크 형성 유닛 ( pfu ) 을 SPE 확인 에 사용 하 였 다 . 필터 리프트 ( filter lift ) 로부터 선택 된 양성 클론 을 LAG - 3 - huFc 및 Δ D 1 D 2 - LAG - 3 - huFc 로 의 LAG - 3 항원 결합 에 대하 여 테스트 하 였 다 . D 1 - D 2 특이 적 바인더 를 PCR 에 의해 항원 양성 파지 로부터 증폭 시키 고 시퀀싱 하 였 다 . Ig 경쇄 V 유전자 ( VL ) 및 VH 서열 을 분석 하 여 고유 한 서열 을 확인 하 고 서열 다양 성 을 결정 하 였 다 .