P . 알바 이소프렌 신 타아 제 PCR 생성물 을 이후 1 ㎕ BspHI 엔 도 뉴클레아제 ( New England Biolabs ) 와 함께 2 ㎕ 1 OX NEB 완충액 4 를 함유 하 는 20 ㎕ 반응물 에서 소화 시켰 다 . 반응물 을 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 소화 된 PCR 절편 을 이후 QIAquick PCR Purification 키트 를 사용 하 여 정제 하 였 다 . 제 2 제한 소화 를 1 ㎕ PstI 엔 도 뉴클레아제 ( Roche ) 와 함께 2 ㎕ 1 OX 완충액 H 를 함유 하 는 20 ㎕ 반응물 에서 수행 하 였 다 . 반응물 을 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 소화 된 PCR 절편 을 이후 QIAquick PCR Purification 키트 를 사용 하 여 정제 하 였 다 . 플라스미드 pTrcHis 2 B ( Invitrogen Corp . ) 를 1 ㎕ NcoI 엔 도 뉴클레아제 ( Roche ) , 1 ㎕ PstI 엔 도 뉴클레아제 , 및 2 ㎕ 10 X 완충액 H 를 함유 하 는 20 ㎕ 반응물 에서 소화 시켰 다 . 반응물 을 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 소화 된 pTrcHis 2 B 벡터 를 1 . 2 % E - 겔 ( Invitrogen Corp . ) 을 사용 하 여 겔 정제 하 고 , QIAquick Gel Extraction 키트 ( Qiagen ) 를 사용 하 여 추출 하 였 다 ( 도 56 ) . BspHI 및 NcoI 위치 의 양립 성 부착 말단 을 사용 하 여 , 5 ㎕ P . 알바 이소프렌 신 타아 제 삽 입물 , 2 ㎕ pTrc 벡터 , 1 ㎕ T 4 DNA 리가아제 ( New England Biolabs ) , 2 ㎕ 10 X 리가아제 완충액 및 10 ㎕ ddH 2 O 를 함유 하 는 20 ㎕ 라 이게 이 션 반응물 을 제조 하 였 다 . 라 이게 이 션 혼합물 을 실온 에서 40 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . ddH 2 O 의 페트리 접시 에 0 . 025 ㎛ 니트로셀룰로오스 막 필터 ( Millipore ) 를 띄우 고 실온 에서 30 분 동안 라 이게 이 션 혼합물 을 니트로셀룰로오스 막 필터 상부 에 조심 스럽 게 도포 시켜 라 이게 이 션 혼합물 을 탈염 시켰 다 . MCM 446 세포 ( II 부분 참조 ) 를 LB 에서 중간 로그 상 까지 성장 시킨 후 얼음 냉각 된 멸 균수 로 3 회 세척 하 였 다 . 50 ㎕ 의 세포 현탁액 분취 액 을 5 ㎕ 의 탈염 된 pTrc P . alba HGS 라 이게 이 션 믹스 와 혼합 하 였 다 . 세포 현탁액 혼합물 을 Gene Pulser Electroporator 를 사용 하 여 2 . 5 볼트 및 25 uFd 에서 2 mm 큐벳 내 에서 전기 천공 하 였 다 . 1 ㎖ 의 LB 를 세포 에 즉시 첨가 한 후 , 금속 마개 를 갖 는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브 ( Sarstedt ) 에 옮겼 다 . 30 ℃ 에서 2 시간 동안 성장 시켜 세포 가 회수 되게 하 였 다 . 형질전환 체 를 L 한 천 및 50 ㎍/㎕ 카르 베 니 실린 및 10 mM 메 발론 산 상 에서 선별 하 고 , 30 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 다음 날 , 6 개 의 형질전환 체 를 고르 고 , 5 ㎖ L 브 로 쓰 및 50 ㎍/㎕ 카르 베 니 실린 튜브 에서 30 ℃ 에서 하룻밤 동안 성장 시켰 다 . 플라스미드 프 렙 을 QIAquick Spin Miniprep 키트 ( Qiagen ) 를 사용 하 여 하룻밤 배양 물 에서 수행 하 였 다 . 플라스미드 를 증식 시키 기 위한 BL 21 세포 의 사용 으로 인해 , 고품질 플라스미드 DNA 를 수득 하 기 위하 여 PB 완충액 5 X 및 PE 완충액 3 X 를 사용 한 스핀 컬럼 세척 의 변경 을 표준 제조사 의 프로토콜 에 포함 시켰 다 . 플라스미드 를 20 ㎕ 반응물 에서 PstI 로 소화 시켜 올바른 크기 의 선형 절편 을 보증 하 였 다 . 모든 6 개 의 플라스미드 는 올바른 크기 였 고 , 프라이머 MCM 65 , MCM 66 , EL 1000 로 서열 분석 하 기 위해 Quintara Biosciences ( Berkeley , CA ) 로 수송 하 였 다 ( 표 4 ) . DNA 서열 분석 결과 는 모든 6 개 의 플라스미드 가 올바르 다는 것 을 나타냈 다 . 하나 를 고르 고 플라스미드 를 EWL 230 으로 지정 하 였 다 ( 도 57 , 58 A 및 58 B ) .