각 웰 에 반응 완충액 ( 50 mM 의 HEPES pH 7 . 4 , 50 mM 의 mgCl 2 , 0 . 5 mM 의 MnCl 2 , 0 . 2 mM 의 Na 3 VO 4 , 1 mM 의 DTT ) 을 넣 어 희석 된 50 μ L 의 ATP 용액 을 넣 어 최종 농도 를 5 μ M 으로 하 였 다 . 화합물 을 DMSO 로 1 μ L / 웰 또는 DMSO ( 음성 대 조웰 ) 와 상응 되 는 농도 를 함유 하 는 적절 한 농도 로 희석 하 고 , 49 μ L 의 반응 완충액 으로 희석 된 각각 의 키나아제 도메인 재조합 단백질 을 넣 어 반응 을 일으키 며 , 각각 의 실험 은 효소 가 없 는 대 조웰 두 개 웨 을 설정 하 여야 한다 . 37 ℃ 의 셰이커 ( Shake ) ( 100 rpm ) 에 넣 어 1 시간 동안 반응 시켰 다 . T - PBS 로 세 번 세척 하 였 다 . 제 1 항체 PY 99 희석 액 을 100 μ L / 웰 로 넣 고 , 37 ℃ 의 셰이커 에서 0 . 5 시간 동안 반응 시켰 다 . 플레이트 를 T - PBS 로 세 번 세척 하 였 다 . 제 2 항체 겨자무 과산화 효소 로 표기 된 양 항 마우스 의 IgG 희석 액 을 100 μ L / 웰 로 넣 고 , 37 ℃ 의 셰이커 에서 0 . 5 시간 동안 반응 시켰 다 . 플레이트 를 T - PBS 로 세 번 세척 하 였 다 . 2 mg / ml 의 OPD 발색 액 을 100 μ L / 웰 ( 0 . 03 % 의 H 2 O 2 의 0 . 1 M 의 구연산 - 구연산나트륨 완충액 ( pH = 5 . 4 ) 으로 희석 ) 로 넣 고 , 25 ℃ 의 온도 하 에서 빛 이 없 는 조건 하 에서 1 - 10 분 동안 바 응 시켰 다 . 2 M 의 H 2 SO 4 를 50 μ L / 웰 로 넣 어 반응 을 중지 시키 고 , 가변 파장 마이크 로 플레이트 리더 SPECTRA MAX 190 로 리딩 하 면 , 파장 은 490 nm 이 다 .