라 이게 이 션 믹스 를 사용 하 여 XL 1 - Blue 또는 DH 5 알파 수용성 세포 를 형질 전환 시켰 다 . 양성 클론 을 DNA 서열 결정 에 의해 입증 하 였 다 . 구성체 를 KS 474 , TG 1 ( -) 및 BL 21 ( DE 3 ) 을 포함 한 몇몇 이 . 콜라 이 종 에서 발현 시켰 다 . 유도 및 발현 후 에 , 세포 펠 렛 을 - 20 ℃ 에서 동결 시킨 후 , 용해 버퍼 ( 20 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM 이미다졸 , 500 mM NaCl , 50 ml 버퍼 당 EDTA 가 없 는 Complete ( 로슈 ) 1 정제 , 2 mM MgCl 2 , 10 U / ml 벤조 나제 ( 머크 ) [ pH 7 . 4 ] ) 내 에 재현 탁 시켰 다 . 세포 를 얼음 상 에서 초음파 분해 하 고 , 원심 분리 하 였 다 . 상등 액 을 여과 하 고 Ni - NTA 컬럼 상 으로 로딩 하 였 다 . 컬 럼 을 세척 버퍼 ( 용해 버퍼 와 같 지만 20 mM 이미다졸 을 함유 함 ) 로 세척 한 후 , 용출 버퍼 ( 용해 버퍼 와 같 지만 500 mM 까지 의 이미다졸 을 함유 함 ) 로 용출 하 였 다 . 샘플 을 Bis - Tris 겔 ( 인비 트로겐 ) 상 에서 분석 한 후 , Amicon Ultra - 15 튜브 내 에서 농축 시키 고 , 수퍼 덱스 프 렙 등급 컬럼 ( 아머샴 ) 상 으로 로딩 하 고 , PBS [ pH 6 . 5 에서 7 . 2 ] 로 용출 하 였 다 ( 겔 여과 전 에 가벼운 환원 이 때때로 사용 된다 ) . 샘플 을 다시 Bis - Tris 겔 상 에서 분석 하 였 다 . 정제 된 단백질 에 DTT ( 최종 농도 10 μ M ) 를 보충 한 후 , Amicon Ultra - 4 튜브 , 100 k 를 통해 여과 하 여 내독소 를 제거 하 였 다 . DTT 제거 를 위해 HiTrap 탈염 컬럼 을 사용 하 였 다 . pH 5 . 5 에서 50 mM MES 버퍼 내 의 샘플 을 약 4 시간 동안 실온 에서 5 내지 10 몰 과량 의 PEG - 말레 이미드 와 커플링 시키 고 , PEG 화 의 효율 을 SDS - PAGE 및 MS 에 의해 분석 하 였 다 . 과잉 의 PEG 는 HiTrap - SP - FF 컬럼 에 이어 , PBS 또는 Tris 를 사용 한 투석 을 통해 제거 하 였 다 . 상응 하 는 항원 에 대한 결합 은 ELISA 에 의해 입증 하 였 다 . PEG 화 의 부위 를 환원 , 알킬화 및 트립신 소화 에 의해 결정 하 였 다 . 100 ㎍ 의 샘플 을 건조 시키 고 , 100 ㎕ 의 최종 부피 에서 6 . 4 M 우레 아 , 0 . 32 M NH 4 CO 3 및 0 . 01 M DTT 와 함께 30 분 동안 50 ℃ 에서 아르곤 하 에 인 큐 베이 팅 한 후 , IAA 를 첨가 하 고 ( 0 . 03 M ) , 15 분 동안 실온 에서 암소 에서 인 큐 베 이 팅 하 였 다 . 샘플 을 탈염 하 고 , 건조 시킨 후 , 50 ㎕ 의 최종 부피 에서 0 . 8 M 우레 아 , 0 . 04 M NH 4 CO 3 , 0 . 02 M Tris ( pH 10 ) 및 1 ㎍ 트립신 과 함께 인 큐 베 이 팅 하 고 , LC - MS 에 의해 분석 하 였 다 .