화학식 1 의 화합물 에 의한 동종 항원 - 특이 적 인 T 세포 억제 효과 를 확인 하 기 위하 여 인간 혼합 림프구 반응 을 하 기 와 같이 실시 하 였 다 . 두 명 의 정상 인 지원자 의 말초 혈액 세포 ( peripheral blood cells ) 를 상완 정맥 으로부터 항 - 응 고제 가 포함 된 튜브 ( tube ) 에 20 ml 씩 채혈 하 였 다 . 각 혈액 샘플 은 실온 에서 1200 분당 회전 ( revolution per minute ; rpm ) 의 속도 로 5 분 간 원심 분리 하 여 혈장 을 제거 하 고 침전 된 혈액 분획 을 20 ml 의 인산 완충 식염수 ( Phosphate buffered saline ; PBS ) 에 현 탁 ( suspension ) 시켰 다 . 50 ml 원심 분리 튜브 에 20 ml 의 피 콜 ( FicoIl , sigma ) 용액 을 담 고 혈액 샘플 을 상층 한 후 , 실온 에서 1500 rpm 의 속도 로 30 분 간 원심 분리 하 였 다 . 원심 분리 후 말초 혈액 세포 층 ( peripheral blood mononuclear cells ) 을 회수 하 여 PBS 로 세척 한 다음 , 1 ml 의 PBS 에 재현 탁 ( resuspension ) 하 였 다 . 2 개 의 말초 혈액 세포 중 하나 를 5 M 농도 의 카르복시 플 루오 레신 디아세테이트 ( carboxyfluorescein diacetate ) 를 처리 하 고 실온 에서 8 분 동안 반응 시킨 후 , 냉장 보관 된 5 % 우태 혈청 ( fetal bovine serum ; FBS ) - PBS 를 넣 어 반응 을 중지 시키 고 세척 하 였 다 . 세척 된 세포 를 RPMI - 우태 혈청 10 % 배지 에 2 × 106 / ml 개 로 재현 탁 시켜 반응 세포 ( responder ) 로 준비 하 였 다 . 나머지 하나 의 분리 된 말초 혈액 세포 에 50 ㎍/ ml 의 미토마이신 - c ( mitomycin - c , sigma - aldrich ) 를 처리 하 고 37 ℃ 에서 20 분 간 반응 시킨 후 , PBS 로 3 회 세척 하 였 다 . 세포 를 RPMI - 우태 혈청 10 % 배지 에 2 × 106 / ml 개 로 재현 탁 시켜 자극 세포 ( stimulator ) 로 준비 하 였 다 . 각 반응 세포 와 자극 세포 를 1 : 1 비율 로 혼합 하 여 96 - 웰 배양 플레이트 ( coster ) 에 200 ㎕ 씩 분주 하 였 다 . 각 웰 에 분주 된 세포 에 RPMI 배지 로 희석 된 다양 한 농도 의 화합물 을 10 ㎕ 씩 처리 하 고 90 시간 동안 CO 2 세포 배양기 에서 배양 하 였 다 . 대 조군 으로 는 10 ㎕ 의 0 . 05 % 디 메틸 설 폭 사이드 ( dimetylsulfoxide , DMSO ) / RPMI 배지 를 처리 하 였 다 .