CDR 를 제거 하 였 고 중첩 PCR 에 의해 고유 제한 부위 로 치환 하 였 다 . 정 방향 프라이머 H 1 , H 2 . H 3 , L 1 , L 2 및 L 3 ( 표 2 ) 를 디자인 하 여 중 / 경쇄 가변 영역 내 CDR 1 , 2 및 3 를 각각 치환 하 였 다 . 각각 의 프라이머 는 중앙 에 위치 한 , 제거 될 CDR 서열 이 결여 되 고 야생 형 서열 의 10 - 20 bp 로 플 랭킹 되 는 선택 된 고유 효소 인식 서열 ( 녹색 부분 ) 을 포함 하 였 다 . 정 방향 프라이머 는 각각 야생 형 작 제물 pOrigHIB 및 pOrigLIB 내 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 과 어닐링 되 는 범용 역방향 프라이머 huHeClonR 또는 huLiClonR ( 표 2 ) 와 함께 PCR 의 제 1 라운드 에 사용 하 였 다 . 생성 된 단편 은 야생 형 CDR 서열 ( 적색 부분 ) 을 포함 하 지 는 않 지만 , 제한 부위 와 효과 적 으로 교체 된다 . 전체 가변 중쇄 및 경쇄 영역 을 증폭 하 기 위하 여 , 단일 플라스미드 내 CMV 프로모터 와 어닐링 되 는 범용 CMV 정 방향 프라이머 를 갖 는 역방향 프라이머 로서 제 1 라운드 로부터 생성 된 PCR 산물 을 사용 하 는 PCR 의 제 2 라운드 가 요구 된다 . 제 2 라운드 PCR 산물 을 pCR 2 . 1 ( Invitrogen ) 에 서브 클로닝 하 고 , 서열 확인 후 , H 1 , H 2 , H 3 , L 1 , L 2 및 L 3 버전 을 단독 으로 , 조합 하 여 및 함께 포함 하 는 중쇄 / 경쇄 ( VH 및 VL ) 가변 영역 을 단일 작 제물 pOrigHIB 및 pOrigLIB 에 다시 삽입 하 여 , 각각 HindIII / AfeI 및 BamHI / BsiWI 를 사용 하 여 야생 형 영역 을 교체 하 였 다 .