스크리닝 전략 을 인 - 셀 웨스턴 검정 을 사용 하 여 실행 하 여 시험관 내 에스트로겐 수용체 를 분해 하 는 그 의 능력 을 측정 하 였 다 . 에스트로겐 수용체 양성 인 MCF 7 세포 를 흑색 벽 투명 한 바닥 96 - 웰 플레이트 내 로 3 . 5 E - 05 개 의 세포 / ml 의 세포 밀도 로 플 레이팅 하 였 다 . 세포 를 가습 된 37 ℃ 인큐베이터 에서 24 시간 동안 8 % 목탄 - 스 트리핑 태아 소 혈청 이 보충 된 페놀 레드 무함 유 둘 베코 변형 이 글 배지 ( DMEM ) 중 에 인 큐 베이 션 하 였 다 . 농축 된 스톡 화합물 을 완전 배지 중 에 10 X 로 희석 하 였 다 . 화합물 을 1 E - 12 내지 1 E - 05 M 의 범위 이 도록 용량 - 의존 성 방식 으로 플 레이팅 된 세포 에 첨가 하 고 , 37 ℃ 에서 추가 의 24 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 배양 배지 를 완만히 뒤집 어서 배양 플레이트 로부터 제거 하 였 다 . 세포 를 실온 에서 15 분 동안 1 X 포스 페이트 완충 된 염수 - 칼슘 마그네슘 무 함유 ( PBS - CMF ) 중 의 4 % 파라포름알데히드 에 고정 하 고 , 각각 1 X PBS - CMF 에서 5 분 동안 3 회 세척 하 였 다 . 세포 를 0 . 3 % 트리톤 X 100 을 함유 하 는 면역 형광 ( IF ) 차단 완충제 ( 셀 시그널 링 # 12411 ) 내 에 투과 화 시켰 다 . 세포 를 각각 1 X PBS - CMF 에서 5 분 동안 3 회 세척 하 고 , IF 항체 희석 완충제 ( 셀 시그널 링 # 12378 ) 중 에 1 : 300 으로 희석 된 에스트로겐 수용체 α ( D 6 R 2 W ) 토끼 1 차 항체 ( 셀 시그널 링 # 13258 ) 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 세포 를 각각 1 X PBS - CMF 에서 5 분 동안 3 회 세척 하 고 , IF 항체 희석 완충제 중 에 1 : 2000 으로 희석 된 염소 항 - 토끼 ( 바 이오티 움 # CF 770 ) 2 차 항체 및 1 : 500 으로 희석 된 정규화 스테인 셀 태그 ( CellTag ) 700 ( 리코 르 # 926 - 41090 ) 로 염색 하 였 다 . ER 단백질 발현 을 이미지 스튜디오 v 5 . 2 를 사용 하 여 리코 르 오디세이 CLx 영상 화 시스템 에 의해 평가 하 였 다 . 그래프 패드 프리즘 7 을 사용 하 여 데이터 를 비 히 클 로부터 배경 을 감산 하 고 , 비 히 클 을 100 % ER 활성 으로 설정 한 다음 , 처리 된 샘플 을 비 히 클 과 비교 함 으로써 가공 하 였 다 . 이 절차 를 사용 하 여 도 2 , 도 3 , 도 4 , 도 5 , 도 6 , 도 7 및 도 8 에서 의 그래프 를 작성 하 였 다 .