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 JoVE Immunology and Infection 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
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 Cite this Article : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
 Abstract : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 Ictalurus punctatus 의 주요 병원체 이 며 1 , 2 전 약 30 년 간 을 발견 하 고 있 는 동안 , 지금 까지 , 이 작가 ' 지식 의 최고 에 , 어떤 방법 의 현장 시각화 에 수 있 도록 개발 되 지 않 았 습니다 histological 섹션 에 박테리아 . 세균성 지방 화 는 플레이트 카운트 3 , radiometric 표시 된 4 , 또는 발광 생물 세균 5 를 사용 하 고 이전 의 연구 에서 생체 내 결정 하 고 있 는 동안 , 이러 한 연구 의 대부분 은 한 가지 예외 를 제외 하 고 6 , 총 장기 수준 에서 수행 되 었 습니다 . 이 제한 은 특히 우려 때문 에 E . ictaluri 는 복잡 한 감염 사이클 1 , 7 을 가지 고 있 으며 , 그것 은 독성 요인 8 , 9 다양 한 있 습니다 . E . 의 복잡 한 상호 작용 그 호스트 ictaluri 같 은 taxonomic 가족 에 살모넬라 균 10 , 많 은 측면 에서 비슷 합니다 . 여기 에 인 즈 워스 외 의해 설명 되 어 있 는 단 클론 항체 를 사용 하 여 Ed 9 간접 단백질 histochemistry . 11 을 사용 하 여 박테리아 의 탐지 를 위해 허용 하 는 방법 을 설명 합니다 . 간단히 차단 혈청 가 아닌 특정 기다리 는 을 방지 하 기 위해 파라핀 임베디드 histological 섹션 에 적용 됩니다 . E . 그런 다음 섹션 은 기본 항체 와 incubated 아르 ictaluri 특정 단 클론 항체 Ed 9 . 초과 항체 가 떨어져 씻 어서 되 고 FitC 라벨 이 차 항체 가 추가 됩니다 . rinsing 후 , 섹션 은 형광 등 특정 설치 매체 로 탑재 하 고 있 습니다 . 이것 은 E . 의 검색 허용 채널 메기 조직 의 histological 섹션 에 현장 에 ictaluri . Protocol : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
 1 . 세균 도전 30 박테리아 가 하룻밤 사이 에 성장 ° 뇌 심장 주입 용기 를 흔들 어 에서 C . 물고기 탱크 의 물 순환 을 중지 하 고 100 1 농도 ( 리터 당 10 ML , 예 를 들 어 ) 에 국물 을 추가 합니다 . 한 시간 부화 후 , 남 아 있 는 세균 을 제거 하 기 위해 탱크 에 물 을 순환 을 다시 시작 합니다 . 2 . 샘플링 샘플링 시간 과 기관 은 연구 의 목적 의존 하 지만 우리 연구 에서 , 우리 는 다음 과 같 은 샘플링 포인트 사용 : 1 , 6 , 16 , 24 , 36 , 48 , 60 , 72 , 96 , 1 ​ 10 , 125 및 175 시간 후 감염 . 아가미 , 측면 라인 , 소장 , 비장 따라 사후 근육 , 각 시간 점 에서 MS 222 과 샘플 다음 과 같 은 장기 ( 샘플 기관 의 선택 은 감염 과정 의 알려진 내용 에 기초 ) 가 포함 된 물 에 침수 에 의해 여섯 물고기 를 안락사 간 , 위 , 심장 , 머리 를 신장 하 고 , 트렁크 신장 . 샘플링 시 즉시 histological 카세트 에서 장기 하중 , 1 % 포르말린 에 두 시간 동안 그 들 을 담가 . 그 들 은 삽입 때 까지 남 아 두 명 의 시간 고정 후 , 포르말린 에서 50 % 에탄올 로 카세트 를 전송 합니다 . 파라핀 은 하룻밤 조직 테크 VIP 3000 조직 프로세서 ( 사쿠라 테크 , 토랜스 , 캘리  포니 아주 ) 와 Leica RM 2255 microtone 을 ( Leica 이크 로 시스템즈 , 배 녹 번 , 일리 노 이주 ) 를 사용 하 여 5 μ m 에서 섹션 을 사용 하 여 장기 포함 . 3 . Dewaxing 섹션 디졸브 모든 왁스 수 있 도록 약 5 분 맑 은 의식 으로 가득 얼룩 여물 섹션 젖 어 . 랙 을 들 어 여분 의 왁스 는 용매 에서 배수 . 5 분 분명 라이트 의 두 번 째 용기 에 섹션 젖 어 . 몇 가지 사용 후 , 첫 번 째 와 두 번 째 컨테이너 사이 의 첫 번 째 컨테이너 와 대체 의 용매 를 교체 하 십시오 . 왁스 는 용매 제거 100 % 알콜 에 있 는 섹션 을 잠그 다 . 100 % 알코올 의 두 번 째 여물 섹션 젖 어 . 70 % 알콜 의 여물 섹션 젖 어 . 알코올 의 모든 흔적 을 제거 하 는 수돗물 을 실행 에 있 는 섹션 을 잠그 다 . 4 . 버퍼 준비 칼륨 은 7 . 4 에 증류수 와 산도 의 1 리터 에 8 . 0 g NaCl , 0 . 2 g KCl , 1 . 15 g 나 2 HPO 4 0 . 2 g KH 2 PO 4 용해 하 여 생리 버퍼 준비 합니다 . 증류수 100 ML 에 PBS 900 ML 추가 하 여 0 . 9 X 에 PBS 를 희석 . 2 ML 마우스 혈청 을 추가 하 여 혈청 차단 준비 200 μ l 트리톤 - X 100 , 500 μ l PBS BSA 0 . 9 X 50 ML 에 있 습니다 . 50 MM 의 비 카보 네이트 버퍼 살린 500 ML 증류수 H 2 O 에서 2 . 1 g NaHCO 3 4 g NaCl 을 해소 하 고 산도 8 . 2 titrated 에 의해 준비 가 되 어 준비 합니다 . 5 . Immunhistochemistry 0 . 9 X PBS 에서 침수 로 섹션 을 Rehydrate . 혈청 을 차단 30 분 동안 슬라이드 를 품 어 . 상온 에서 불 투명 습한 챔버 에 두 시간 동안 Ed 9 ( 차단 혈청 에서 100 에 1 을 희석 ) 에 섹션 을 품 어 . 십 분 각 섹션 에게 PBS 로 4 번 린스 . 상온 에서 불 투명 습한 챔버 에서 , 보조 항체 의 50 μ l ( 혈청 차단 500 번 희석 염소 방지 마우스 FitC 표시 항체 ) 에 두 시간 섹션 을 품 어 . 비 카보 네이트 3 시간 이 호수 버퍼 섹션 린스 . 탈 이온 수 에서 잠시 섹션 린스 . 6 . 설치 몇 분 동안 어둠 속 에서 건조 하 는 슬라이드 를 둡니다 . 장착 은 permafluor 를 사용 하 여 수행 됩니다 . 장착 매체 어두운 시원 한 환경 에서 , 우선 적 으로 야간 , 건조 에 둡니다 . 7 . 현미경 Histological 섹션 형광 현미경 으로 관찰 하 기 위해 준비 가 되 어 있 습니다 . 필터 , 우리 의 실험 에서 , 우리 는 트리플 ( MCA 텍사스 - 레드 FitC ) 을 갖춘 올림푸스 BX 51 현미경 을 사용 . 액자 소프트웨어 ( MicroFire , 골 레타 , 캘리포니아 ) 이 사용 되 었 다 . 8 . 대표 결과 : 물고기 조직 의 자동 형광 그렇게 높이 때문 에 , 이 조직 은 편리 박테리아 에 대한 배경 을 제공 트라이 필터 아래 에 오렌지 가 나타납니다 . 이 배경 , 개별 FitC 묻 은 ​ 박테리아 는 밝 은 녹색 점 들 로 표시 되 며 , 200 X 에서 자신 의 막대 모양 은 ( 그림 1 ) 인식 할 것 입니다 . 잘못 된 부분 은 박테리아 의 큰 숫자 가 균일 하 게 슬라이드 에 있 는 것 으로 표시 되 는 경우 ( rinsing 단계 에서 이 문제 로 인해 ) 잘못 된 긍정 을 구성 하 실 수 있 습니다 . 그림 1 . 2 E . 보여 주 는 근육 섹션 현미경 ictaluri ( 화살표 A 와 B ) ( 200 x ) . igure 2 "/> 그림 2 . 실험 의 전체 구조 Subscription Required . Please recommend JoVE to your librarian . 	 Discussion : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
 이 프로토콜 세부 histological 섹션 에서 메기 병원체 Edwardsiella ictaluri 의 현장 시각화 에 대한 기술 . 우리 의 지식 의 최고 하 려면 , 이 설명 첫 번 째 와 같 은 프로토콜 입니다 . 가장 중요 한 단계 는 , 우리 의 경험 , 잘 못 된 긍정 을 초래 할 수 로 불충 분한 세척 으로 현재 프로토콜 의 단계 4 . 4 에서 설명 하 는 항체 의 rinsing 입니다 . 이 기법 의 결과 를 해석 과 함께 가장 큰 문제 는 조직 의 자동 형광 이 다 . 그러나 , 그것 은 아닌 특정 형광 의 대다수 로 트라이 필터 대부분 해결 되 는 문제 를 사용 하 면 녹색 형광 스펙트럼 의 밖 에서 발생 하 는 것 으로 나타났 다 . 또한 , 이 기법 은 매우 민감 한 반면 , 그것 은 낮 은 박테리아 하중 을 감지 하 지 못할 수 있 습니다 . Subscription Required . Please recommend JoVE to your librarian . 	 Disclosures : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
 Acknowledgements : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
 저자 는 그 들 의 지원 은 개발 과 immunohistochemistry 를 수행 하 는 기술 미쉘 베인스 의 지원 뿐 만 아니 라 박사 페트리 - 핸슨 박사 와 티모시 브라운 에 얼스 를 인식 하 고 싶 습니다 . 이 프로젝트 는 USDA 크리스 프로젝트 # MISV - 0801310 로 및 동물 용 의약품 의 미시시피 주립 대학 에 의해 투자 되 었 다 . Materials : 의 검출 을 위한 형광 단백질 화학 의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기 에 ( I . punctatus ) 샘플 
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