레바 우디 오시드 A 로부터 레바 우디 오시드 M 의 형성 을 용이 하 게 하 기 위한 조작 된 라운드 16 SuS 변이체 의 수크로스 및 ADP 에 대한 활성 을 특성 화 하 기 위해 실험 을 수행 하 였 다 . 진탕 플라스크 분말 ( SFP ) 을 인산칼륨 완충제 , pH 6 에 14 . 5 g / L RebA 60 내의 0 . 03 - 1 g / L 로 만들 고 , 분취 액 을 1 시간 동안 열 순환기 에서 75 ℃ 에서 예비 인 큐 베이 팅 하 였 다 . 10 μ L 의 희석 된 , 예비 인 큐 베이 팅 된 또는 예비 인 큐 베이 팅 되 지 않 은 SuS 용해 물 , 0 . 08 g / L β 1 , 2 GT SFP 서열 번호 7784 , 및 0 . 2 g / L β 1 , 3 GT SFP 서열 번호 8088 을 20 g / L RebA 60 , 0 . 025 g / L ADP ( Amresco , 초 순수 등급 ) , 40 g / L 수크로스 ( 자당 ) , 및 9 . 6 g / L 프럭토스 와 함께 100 μ L 반응 부피 에서 사용 하 였 다 . 하 기 반응 조건 을 사용 하 였 다 : 16 - 18 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 6 , 60 ℃. 상기 설명 한 반응물 은 물 에 20 배 희석 하 여 가용화 하 고 , 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 아 세토 니트릴 에 5 배 희석 함 으로써 켄 칭 하 고 , 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 상청 액 을 물 에 20 배 희석 한 후 , 스 테 비올 글리코시드 생성물 을 표 31 . 1 에 기재 된 기기 및 파라미터 를 사용 하 여 RapidFire SPE - MS / MS 에 의해 검출 하 였 다 . 표 42 . 2 에 나열 된 8 개 의 모든 변이체 는 예비 인 큐 베이 팅 후 에 서열 번호 8420 보다 더 많 은 생 성 을 보였 다 . 서열 번호 8420 과 비교 하 여 가장 개선 된 돌연변이 D 12 S , R 136 Q , R 139 K , A 517 P , G 603 Q , L 630 M , A 642 V , 및 V 756 C ( 서열 번호 8910 ) 를 갖 는 변이체 가 글루코스 를 수크로스 로부터 ADP 로 전달 하 는 재순환 반응 의 촉매 작용 을 위한 최상 의 효소 로서 선택 되 었 다 .