WIL 2 - S SF 현 탁 세포 의 정제 된 항체 변이체 의 결합 을 유동 세포 측정 법 에 의해 분석 하 였 다 . 세포 를 수거 하 고 , 계수 하 고 , PBS 중 에서 세척 하 고 , 배양 배지 에 3 . 33 x 106 개 세포 / mL 로 재현 탁 시켰 다 . 30 μ L 세포 ( 웰 당 1 x 105 개 세포 ) 를 96 - 웰 플레이트 에 피펫 팅 하 였 다 . 50 μ L 의 일련 의 항체 적정 샘플 ( 3 배 희석 으로 범위 0 . 001 - 2 . 5 μ g / mL 최종 항체 농도 ) 을 첨가 하 고 , 37 ℃ 에서 15 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 후속 적 으로 , 20 μ L 의 정제 된 C 1 q ( 2 . 5 μ g / mL 최종 농도 ) 를 첨가 하 고 , 4 ℃ 에서 45 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 100 μ L FACS 완충제 ( PBS + 0 . 1 % ( w / v ) 소 혈청 알부민 ( BSA ) + 0 . 02 % ( w / v ) 아지드 화 나트륨 ) 를 첨가 한 후 , 세포 를 150 μ L FACS 완충제 로 2 회 세척 하 였 다 . 세척 된 세포 를 50 μ L 의 FITC - 표지 된 토끼 항 - 인간 C 1 q 항체 ( 20 μ g / mL 최종 농도 ; 다코 카탈로그 번호 F 0254 ) 와 함께 4 ℃ 에서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 100 μ L FACS 완충제 를 첨가 하 고 , 세포 를 FACS 완충제 로 2 회 세척 하 였 다 . 세포 를 30 μ L FACS 완충제 중 에 재현 탁 시키 고 , 아이큐 스 크리너 ( iQue Screener ) ( 인텔리 사이트 ( IntelliCyt ) ) 를 사용 하 여 유동 세포 측정 법 에 의해 형광 을 측정 하 였 다 . 로그 변환 된 C 1 q 농도 축 을 갖 는 결합 곡선 을 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 를 사용 하 여 비 선형 회귀 분석 ( 가변 기울기 를 갖 는 S 자형 용량 - 반응 ) 을 사용 하 여 분석 하 였 다 . 도 11 C , D 는 항 - DR 5 항체 IgG 1 - CONA - C 49 W 내 E 333 S 또는 E 430 G 치환 만 의 도입 이 DR 5 - 양성 WIL 2 - S SF 세포 에 결합 된 항체 에 대한 C 1 q 결합 에 대해 효과 가 없 었 다는 것 을 보여준다 ( 도 11 C ) . 항 - DR 5 항체 IgG 1 - CONA - C 49 W 또는 IgG 1 - CONA - C 49 W - E 430 G 내 K 326 W 돌연변이 의 도입 은 항 - DR 5 항체 - 옵소닌 화 된 WIL 2 - S SF 세포 에 대한 증가 된 C 1 q 결합 을 유발 하 였으며 , 이 는 IgG 1 - CONA - C 49 W - K 326 W / E 333 S / E 430 G 로 옵소닌 화 된 세포 에 대해 관찰 된 증가 된 C 1 q 결합 과 일치 하 였 다 ( 도 11 C , D ) . 항 - DR 5 항체 IgG 1 - CONA - C 49 W - E 430 G 내 E 333 S 의 도입 은 항체 - 옵소닌 화 된 WIL 2 - S SF 세포 에 대한 C 1 q 결합 의 보통 의 증가 를 유발 하 였 다 ( 도 11 D ) . 이 들 유동 세포 측정 법 데이터 는 세포 - 결합 된 IgG 1 - CONA - C 49 W - K 326 W / E 333 S / E 430 G 가 가장 큰 결합력 의 C 1 q 결합 을 보였 다는 것 을 나타낸다 .