EGFP 를 안정 하 게 발현 하 는 리포터 세포주 ( 293 멀티 GFP ) 를 사용 하 여 , 이중 돌연변이체 의 온 - 타 겟 활성 ( sgGFPon ) 을 , EGFP 코딩 서열 내 로 프레임 시프트 돌연변이 에 의해 도입 된 형광 의 소실 을 측정 함 으로써 시험 하 였 다 . 병행 하 여 , PAM 트리 뉴클레오티드 로부터 원위 의 위치 ( sgGFP 18 에 대해 위치 18 및 sgGFP 1819 에 대해 위치 18 - 19 ) 에서 의 1 개 또는 2 개 의 미스 매칭 된 염기 의 sgRNA 내로 의 도입 후 에 동일 한 부위 의 절단 을 회피 하 는 그 들 의 능력 을 평가 하 였 다 . 야생형 SpCas 9 는 , 그것 이 EGFP + 세포 의 백분율 의 동일 한 감소 를 생성 하 는 , 매칭 된 및 미스 매칭 된 sgRNA 둘 다 에 의해 가이드 되 는 경우 에 동등 한 효율 로 타 겟 서열 을 절단 하 였 다는 관찰 에 의해 확인 된 바 와 같이 , 이 들 대용 오프 - 타 겟 서열 을 식별 할 수 없 었 다 ( 도 5 a ) . 선택 의 제 1 라운드 후 , 성능 이 상위 인 치환 을 EGFP 리포터 세포주 의 챌린지 를 반복 하 는 데 사용 된 삼중 돌연변이체 내 로 조합 하 였 다 ( 도 5 b ) . 그 후 , 이전 의 라운드 의 가장 양호 한 치환 ( VNEL 변이체 ) 을 조합 함 으로써 사중 돌연변이체 를 생성 한 후 선택 의 마지막 라운드 를 수행 하 였 다 . 또한 , 보다 PAM - 근위 영역 ( 위치 13 및 14 , sgGFP 1314 ) 에 2 개 의 미스 매치 를 함유 하 는 또 다른 sgRNA 를 시험 하 여 VNEL 변이체 의 충실 도 의 관찰 된 증가 가 전체 스 페이서 서열 에 걸친 돌연변이 에 대해 보존 되 었 는지 를 확인 하 였 다 . VNEL 변이체 는 모든 미스 매칭 된 가이드 RNA 에 대해 EGFP 형광 의 소실 을 거의 또는 전혀 유도 하 지 않 았 으며 , 이 는 PAM 으로부터 위치 18 에 단일 치환 을 함유 하 는 sgRNA ( sgGFP 18 ) 에 대해 특히 놀라운 결과 이 다 . 한편 , 이러 한 특이 성 의 강한 증가 는 온 - 타 겟 활성 의 작 지만 측정 가능 한 감소 를 생성 하 였 다 ( 약 20 % 소실 , 도 5 c ) . 이러 한 문제 를 다루 기 위해 , VNEL 변이체 의 2 가지 대안 적 인 유도체 ( VNEQ 및 VNES 변이체 ) 를 합리 적 설계 에 의해 생성 하 고 , 동일 한 EGFP 넉 아웃 검정 을 사용 하 여 시험 하 였 다 . 예상 된 바 와 같이 , 온 - 타 겟 절단 효율 의 완전 한 복원 이 오프 - 타 겟 활성 의 작 은 증가 와 병행 하 여 관찰 되 었 다 . 전체 적 으로 , VNEQ 변이체 돌연변이체 는 가장 양호 한 온 / 오프 타 겟 비 를 제시 하 였 다 ( 도 5 c ) .