말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC ) 를 밀도 구배 원심 분리 를 이용 하 여 인간 말초 혈액 연막 으로부터 단리 하 였 다 . NK 세포 ( CD 3 - CD 56 +) 를 자성 비드 에 의한 음성 선택 을 이용 하 여 PBMC 로부터 단리 하 였 고 , 단리 된 NK 세포 의 순도 는 전형 적 으로 > 95 % 이 었 다 . 이어서 , NK 세포 을 세포독성 검정 에서 사용 하 기 전 에 100 ng / mL IL - 2 를 함유 하 는 배지 에서 밤새 배양 하 였 다 . 다음 날 , NK 세포 를 신선 한 배양 배지 중 에서 5 x 105 / mL 로 재현 탁 시켰 다 . 인간 유방암 세포 SkBr - 3 세포 를 퍼킨 엘머 DELFIA 세포독성 키트 에 따라 BATDA 시약 으로 표지 화 하 고 , 배양 배지 중 에서 5 x 104 / mL 로 재현 탁 시켰 다 . 다중 - 특이 적 결합 단백질 의 다양 한 희석 액 을 배양 배지 로 만들 었 다 . 이어서 , NK 세포 , 표지 화 된 SkBr - 3 세포 및 다중 - 특이 적 결합 단백질 을 마이크 로 타이 터 플레이트 의 웰 에서 조합 하 고 , 37 ℃ 에서 3 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 인 큐 베이 션 후 에 , 20 μ l 의 배 양물 상청 액 을 제거 하 고 , 200 μ l 의 유로퓸 용액 과 혼합 하 고 , 어두운 곳 에서 진탕 하 면서 15 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 시간 - 분해 형광 모듈 을 구비 한 페라스 타 플레이트 판독기 에 의해 시간 에 걸쳐 형광 을 측정 하 였 고 ( 여기 337 nm , 방출 620 nm ) , 특이 적 용해 를 키트 지침 에 따라 계산 하 였 다 . AL 0 . 2 는 HER 2 - 결합 도메인 ( 트라 스투 주 맙 ) , NKG 2 D - 결합 도메인 ( SEQ ID NO : 1 - 44 로부터 선택 됨 ) 및 인간 IgG 1 Fc 도메인 을 함유 하 는 다중 - 특이 적 결합 단백질 이 다 . 이 는 트라 스투 주 맙 동종 이량체 및 항 - NKG 2 D 동종 이량체 로부터 출발 하 여 조절 된 Fab - 아암 교환 반응 ( cFAE ) 을 통해 제조 되 었 다 . AL 0 . 2 si 는 AL 0 . 2 를 기반 으로 하 고 , CD 16 결합 을 제거 하 는 Fc 도메인 에서 의 추가 의 D 265 A 돌연변이 을 함유 한다 . 트라 스투 주 맙 - si 는 트라 스투 주 맙을 기반 으로 하 고 , CD 16 결합 을 제거 하 는 Fc 도메인 에서 의 추가 의 D 265 A 돌연변이 를 함유 한다 . AL 2 . 2 는 HER 2 - 결합 도메인 ( 트라 스투 주 맙 ) , NKG 2 D - 결합 도메인 ( ULBP - 6 ) 및 인간 IgG 1 Fc 도메인 을 함유 하 는 다중 - 특이 적 결합 단백질 이 다 . SC 2 . 2 는 트라 스투 주 맙으로부터 유래 된 scFv , 및 ULBP - 6 을 포함 하 는 단일 쇄 단백질 이 다 .