앰 플리 콘 의 중심 에 위치 하 는 gRNA 프로 토스 페이서 서열 을 갖 는 , 대략 160 내지 300 염기쌍 길 이 범위 의 앰 플리 콘 크기 를 목표 로 하 는 디폴트 매개변수 를 사용 하 는 , Primer 3 ( 버전 2 . 3 . 6 , 문헌 [ Untergasser et al , Nucleic Acids Res . , 2012 40 ( 15 ) : e 115 , PMID : 22730293 ] ) 를 사용 하 여 BCL 11 A + 58 영역 gRNA ( CR 00309 , CR 00311 , CR 00312 , CR 00316 , CR 001125 , CR 001126 , CR 001127 및 CR 001128 ) 및 HPFH 영역 gRNA ( CR 001028 , CR 001030 , CR 001137 , CR 001221 , CR 003035 및 CR 003085 ) 에 대해 확인 된 잠재 적 표적 - 외 유전자좌 ( 및 표적 적중 유전자좌 ) 를 표적 화 하 는 PCR 앰 플리 콘 을 설계 하 였 다 . gRNA CR 001127 에 대해서 는 0 내지 4 뉴클레오타이드 미스 매치 를 갖 는 부위 에 대해서 만 PCR 프라이머 를 설계 하 였으며 , RefSeq 엑손 내 에 5 뉴클레오타이드 미스 매치 를 갖 는 부위 에 대해서 는 프라이머 를 설계 하 지 않 았 다 . 생성 된 PCR 프라이머 쌍 및 앰 플리 콘 서열 을 인간 게놈 참조 서열 ( build GRCh 38 ) 대비 BLAST 서열 검색 ( 버전 2 . 2 . 19 , 문헌 [ Altschul et al , J Mol Biol . , 1990 , 215 ( 3 ) : 403 - 10 , PMID : 2231712 ] ) 하 여 유일 성 을 체크 하 였 다 . 하나 를 초과 하 는 앰 플리 콘 서열 을 야기 하 는 프라이머 쌍 을 폐기 하 고 재 설계 하 였 다 . 표 3 및 표 5 는 BCL 11 A + 58 영역 및 HPFH 영역 gRNA 각각 에 대해 설계 된 성공 적 인 PCR 프라이머 쌍 의 수 를 나타낸다 .