제조사 의 지시 에 따라 항 - CD 3 / CD 28 비드 ( Life Technologies ) 로 활성 화 시킨 CD 8 +/ CD 4 + T 세포 단리 키트 ( Miltenyi Biotec ) 를 사용 하 여 정상 적 인 인간 공 여자 의 PBMC 로부터 CD 8 + 및 CD 4 + T 세포 를 단리 하 고 , 32 ℃ 에서 45 분 동안 2 , 100 rpm 에서 원심 분리 에 의한 활성 화 후 3 일 째 에 0 . 8 μ g / mL 폴리 브렌 ( Millipore , Bedford , MA ) 을 보충 한 PsPAX 2 및 pMD 2 G 패 키 징 플라스미드 ( MOI = 3 ) 를 사용 하 여 HEK 293 T 세포 의 일시 적 인 형질 감염 에 의해 생성 된 CAR - 인코딩 렌 티 바이러스 ( epHIB 7 ) 상등 액 으로 형질 도입 하 였 다 . T 세포 를 48 시간 마다 50 U / mL 의 최종 농도 로 재조합 인간 ( rh ) IL - 2 가 보충 된 RPMI , 10 % 인간 혈청 , 2 mM L - 글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토마이신 ( CTL 배지 ) 에서 확장 하 였 다 . 확장 후 , 각각 의 형질 도입 된 T 세포주 의 분취 량 을 바이오틴 - 접합 항 - EGFL 항체 및 스 트 렙 타비 딘 - PE ( Miltenyi , Auburn , CA ) 로 염색 하 였 다 . tEGFR + T 세포 는 FACS - Aria 세포 분류기 ( Becton Dickinson ) 로 분류 하 여 단리 하 였 다 . 이어 tEGFR + T 세포 서브 세트 를 T 세포 : LCL 비 1 : 7 에서 조사 ( 8 , 000 rad ) 된 CD 19 + B - LCL 로 자극 시키 고 , 48 시간 마다 50 U / mL rh IL - 2 를 첨가 한 CTL 배지 에서 , 또는 항 - BCA 항체 A 7 또는 C 11 D 5 . 3 으로부터 유래 된 scFv 를 포함 하 는 T - ChARM 발현 세포 에 대해 고속 확장 프로토콜 을 사용 하 여 8 일 동안 확장 시켰 다 ( Riddell and Greenberg , J . Immunol . Methods 128 : 189 , 1990 ) .