포유 동물 세포 및 형질 감염 . 293 T / 17 세포 를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ( American Type Culture Collection ) 으로부터 얻 고 ( ATCC 로부터 얻 음 ) , 10 % 소 태아 혈청 ( FCS ; 라이프 테크놀로지 즈 ( Life Technologies ) ) 및 항생제 ( 펜스 트 렙 ( PenStrep ) , 라이프 테크놀로지 즈 ) 로 보충 된 둘 베코 변형 이 글 배지 ( DMEM ; 라이프 테크놀로지 즈 ) 에서 배양 하 였 다 . 293 멀티 GFP 세포 를 pEGFP - IRES - 푸 로 마이신 으로 의 안정 한 형질 감염 에 의해 생성 하 고 , 1 μ g / ml 의 푸 로 마이신 으로 선택 하 였 다 . 293 블라스트 EGFP 를 EGFP - 발현 렌 티 바이러스 벡터 pAIB - GFP 로 의 HEK 293 T 세포 의 저 MOI 감염 , 이어서 5 μ g / ml 의 블라스티시딘 으로 의 클론 선택 에 의해 얻 었 다 . 형질 감염 을 위해 , 1 x 105 293 멀티 GFP 또는 293 T 세포 / 웰 을 24 - 웰 플레이트 에 시 딩 하 고 , 다음 날 400 - 750 ng 의 Cas 9 - 발현 플라스미드 및 200 - 250 ng 의 sgRNA - 발현 플라스미드 를 사용 하 여 트랜스 IT - LT 1 ( 미러스 바이오 ( Mirus Bio ) ) 을 제조자 의 프로토콜 에 따라 사용 하 여 형질 감염 시켰 다 . EGFP 발현 을 수반 한 일시 적 형질 감염 실험 을 위해 , 100 ng 의 pEGFP - N 1 플라스미드 를 사용 하 였 다 . 293 멀티 GFP 내로 의 형질 감염 후 Cas 9 에 의한 EGFP 하향조절 의 수준 을 결정 하 기 위해 , 세포 를 형질 감염 후 7 일 에 수집 하 고 , FACS 칸토 ( FACSCanto ) ( 비디 바이오 사이언 시즈 ( BD Biosciences ) ) 를 사용 한 유동 세포 측정 에 의해 분석 하 였 다 .