근육 세포 인 C 2 C 12 ( ATCC ) 를 10 % FBS ( Hyclone ) 가 함유 된 DMEM ( Hyclone ) 과 함께 6 - 웰 플레이트 에 1 X 105 cell / mL 이 되 도록 넣 었 다 . 세포 밀도 가 약 80 ~ 85 % 가 되 었 을 때 , 웰 에 있 는 배지 를 제거 하 고 2 % HS ( Hyclone ) 가 함유 된 DMEM ( Hyclone ) 을 세포 에 처리 하 여 myotube 분화 를 유도 하 였 다 . 2 일 에 한 번 씩 새로운 배지 로 교체 하 여 총 6 일 동안 분화 를 진행 하 였 다 . 분화 후 , 50 ng / mL tumor necrosis factor alpha ( TNF - α ; PeproTech , Rocky Hills , NJ , USA ) 가 함유 된 DMEM ( Hyclone ) 에 상기 실시 예 1 - 1 내지 1 - 6 의 모자 반류 에탄올 추출물 을 10 ㎍/ mL 의 농도 로 세포 에 처리 하 였 다 . 12 시간 후 , TRIzol 시약 ( Invitrogen , Carlsbad , CA , USA ) 을 사용 하 여 총 RNA 를 분리 하 였 다 . 분리 한 총 RNA 는 나 노드 랍 ( NanoDrop 1000 ; Thermo Fisher Scientific Inc . , MA , USA ) 을 이용 하 여 정량 하 였 다 . 정량 된 16 μ L 의 RNA 를 Reverse Transcriptase Premix ( ELPIS - Biotech ) 와 PCR 기계 ( Gene Amp PCR System 2700 ; Applied Biosystems , MA , USA ) 를 이용 하 여 42 ℃ 55 분 , 70 ℃ 15 분 의 조건 에서 cDNA 로 합성 하 였 다 . 16 μ L 의 생성 된 cDNA 중 3 μ L 의 cDNA , 하 기 의 특정 프라이머 ( Bioneer , Daejeon , Korea ) 그리고 PCR premix ( ELPIS - Biotech ) 로 95 ℃ 에서 30 초 , 60 ℃ 에서 1 분 , 72 ℃ 에서 1 분 을 30 번 반복 하 여 PCR 을 수행 하 였 다 .