플라스미드 및 구축물 . 플라스미드 p 415 - GalL - Cas 9 - CYC 1 t 를 사용 하 여 효모 ( 애드 진 ( Addgene ) 으로부터 얻 음 , # 43804 ) 에서 Cas 9 를 발현 하 였 다 ( Di Carlo JE , et al . , Nucleic Acids Res . 2013 , 41 ( 7 ) : 4336 - 43 ) . 제한 소화 에 의한 Rec 1 - II 도메인 의 정확 한 제거 를 허용 하 기 위해 , 각각 Rec 1 - II 도메인 의 상류 및 하류 에 2 개 의 제한 부위 인 NcoI 및 NheI 를 도입 하 기 위해 , 동의어 적 돌연변이 를 PCR 을 통해 생성 하 였 다 ( 프라이머 에 대해서 는 , 부록 표 2 참조 ) . sgRNA 에 대한 발현 카세트 를 p 426 - SNR 52 p - gRNA . CAN 1 . Y - SUP 4 t 플라스미드 ( 애드 진 으로부터 얻 음 , # 43803 ) 로부터 얻 었 다 ( Di Carlo JE , et al . , Nucleic Acids Res . 2013 , 41 ( 7 ) : 4336 - 43 ) . 원래 스 페이서 서열 을 목적 하 는 타 겟 으로 교체 하 기 위해 , 어셈블리 - PCR 기반 전략 을 채용 하 였 다 . sgRNA 발현 카세트 의 5 ' 부분 을 T 3 정 방향 프라이머 ( SNR 52 프로모터 전 에 어닐링 ) 및 스 페이서 서열 의 바로 상류 에 어닐링 하 고 , 목적 하 는 온 - 타 겟 서열 에 상응 하 는 5 ' 오버행 을 함유 하 는 역방향 프라이머 를 사용 하 여 PCR - 증폭 시켰 다 ( 부록 표 2 참조 ) . 동일 한 것 을 스 페이서 서열 바로 뒤 에 어닐링 하 고 , 이전 에 언급 된 것 과 역 평행 한 5 ' 오버행 을 함유 하 는 프라이머 T 7 역방향 프라이머 및 정 방향 프라이머 를 사용 하 여 sgRNA 의 3 ' 단편 에 대해 수행 하 였 다 . gRNA 카세트 를 얻 기 위한 어셈블리 반응 을 PCR 앰 플리 콘 둘 다를 혼합 하 고 , 단일 단계 의 변성 , 어닐링 및 연장 을 수행 하 고 , 이어서 단지 T 3 및 T 7 외부 프라이머 를 사용 한 지수 적 증폭 에 의해 제조 하 였 다 . 그 후 , 생성 된 단편 을 겔 정제 하 고 , URA 3 효모 선택 가능 한 마커 를 운반 하 는 저 카피 수 동원체 플라스미드 인 pRS 316 ( ATCC ) 내 로 블런트 - 말단 클로닝 하 고 , SacII / XhoI 로 예비 - 소화 시키 고 , 블 런 팅 하 여 pRS 316 - SNR 52 p - gRNA . ON - SUP 4 t 플라스미드 를 생성 하 였 다 .