cDNA 에 실시간 PCR 을 실시 함 으로써 마우스 내 에서 의 mRNA 수준 을 계산 하 기 위해 필요 한 양 의 cDNA 를 얻 을 수 있 다 . 실시간 PCR 은 진 앰프 , 5700 서열 검출 시스템 ( GeneAmp , 5700 Sequence Detection System ) 에서 SYBR ( 등록 상표 ) 그린 PCR 마스터 믹스 ( Green PCR Master Mix ) 를 사용 하 여 하 기 와 같이 수행 될 수 있 다 . 올리 고 뉴클레오티드 는 인 비트 로 젠 ( Invitrogen ) 으로부터 구입 할 수 있 다 . PCR 반응물 은 총 부피 30 ㎕ 내 에 25 ng 의 cDNA , 400 nM 의 각 표적 프라이머 , 및 1 × 최종 농도 의 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 로 구성 된다 . 하 기 의 증폭 변수 를 이용 할 수 있 다 : 50 ℃ 에서 2 분 , 이어서 95 ℃ 에서 10 분 , 및 40 주기 의 95 ℃ 에서 15 초 및 60 ℃ 에서 1 분 . 프라이머 의 특이 성 및 잠재 적 인 프라이머 이량체 를 결정 하 기 위하 여 60 ℃ 에서 추가 의 20 분 동안 반응 을 더 진행 시킨다 . 이중 시료 로 실험 을 진행할 수 있 다 . 수정 된 비교 주기 임계 ( CT ) 방법 ( comparative cycle threshold ( CT ) method ) ( Applied Biosystems ' User Bulletin No . 2 ) 을 사용 하 여 2 ( - Δ ℃ t ) × 10000 의 공식 으로 mRNA 수준 을 계산 한다 . 수치 들 을 상응 하 는 유비퀴틴 관리 유전자 ( ubiquitin housekeeping gene ) 의 수준 에 표준 화 한다 . EAE 를 가진 마우스 들 로서 IK 1 차단제 로 치료 한 경우 와 치료 하 지 않 은 경우 에 대하 여 결과 를 나타낸다 .