구체 적 으로 , 단백질 분석 을 위해 근육 조직 ( 전 경골 근 , 장딴지근 ) 50 mg : RIPA buffer 300 μ L 를 넣 고 균질 화 하 여 , 4 ℃ 에서 12 , 000 rpm 으로 20 분 간 원심 분리 하 였 다 . Bradford assay 으로 단백질 정량 후 , SDS - PAGE ( Poly acrylamide gel electrophoresis ) 를 이용 하 여 size 별 로 분리 하 였 다 . Semi - dry transfer system ( Bio - Rad , USA ) 를 이용 하 여 PVDF membrane 에 이동 시킨 후 5 % skim - milk 를 함유 한 blocking buffer 에서 1 시간 동안 처리 하 였 다 . 1 X TBST buffer 로 10 min , 3 회 세 척 후 1 차 항체 인 p - mTOR ( ser 2481 ) , mTOR , p - AKT ( ser 473 ) , AKT , MuRF - 1 , atrogin - 1 / MAFbx , 및 GAPDH 를 1 : 1000 의 비율 로 처리 한 후 4 ℃, overnight 반응 시켜 1 X TBST buffer 로 10 min , 3 회 세척 하 였 다 . Western blot detection kit 를 이용 하 여 membrane 과 반응 시킨 후 , ChemiDoc 장비 를 이용 하 여 발현 정도 를 관찰 하 였으며 , GAPDH , mTOR 및 AKT 로 보정 하 여 비교 하 였 다 .