사용 한 HMC 방법 은 소 및 돼지 에서 본 발명자 들 의 이전 의 연구 에 기초 하 였 지만 ( Kragh , et al . , 2004 ; Peura and Vajta , 2003 ; Vajta , et al . , 2003 ) , 상당 한 변형 이 있 다 . 간단히 말 해서 , 성숙 의 시작 41 시간 후 에 , COCs 의 난구 세포 외 층 ( cumulus investment ) 을 Hepes - 완충 된 TCM 199 중 의 1 mg / ㎖ 히알루로니다아제 에서 반복 된 피펫 팅 에 의해 제거 하 였 다 . 이 시점 으로부터 ( 달리 나타내 는 경우 를 제외 ) , 모든 조작 을 39 ℃ 로 조절 된 가열 단계 에서 수행 하 였 고 , 난모 세포 를 처리 하 기 위해 사용 한 모든 방울 을 20 ㎕ 부피 의 미네랄 오일 로 덮 었 다 . 난 모세포 를 5 초 동안 T 33 ( T 는 Hepes - 완충 된 TCM 199 배지 ; 숫자 는 CS 보충 물 의 백분율 ( v / v ) 을 의미 , 여기 서 는 33 %) 에 용해 된 3 . 3 mg / ㎖ 프로 나제 에서 간단히 인 큐 베이 션 하 였 다 . 난 모세포 가 프로 나 제 용액 에서 기형화 가 시작 되 기 전 에 , 그것 들 을 집어내 어 T 2 및 T 20 방울 로 재빨리 세척 하 였 다 . 부분 적 으로 분해 되 었 지만 여전히 눈 에 보이 는 층 을 가지 는 난모 세포 를 3 mg / ㎖ 폴리비닐 알코올 ( TPVA ) 및 2 . 5 ㎍/㎖ 시토 칼라 신 B 로 보충 한 T 2 의 방울 에 정렬 시켰 다 . 초미세 칼날 ( Ultra Sharp Splitting Blades ( AB Technology , Pullman , WA , USA ; Fig . 6 a ) ) 로 입체 현미경 조작 하 에서 이등분 대신 삼 등분 을 수동 으로 수행 하 였 다 . 삼등분 된 난모 세포 의 단편 을 수집 하 였 고 5 분 동안 TPVA 방울 에서 5 ㎍/㎖ Hoechst 33342 형광 색소 로 염색 한 후 , 오일 ( 방울 당 3 - 4 단편 ) 로 덮인 60 mm 팔콘 페트리 ( Falcon Petri ) 디쉬 의 바닥 에서 1 ㎕ 방울 TPVA 배지 에 두 었 다 . 역상 현미경 및 UV 광선 을 사용 하 여 , 염색질 염색 없이 단편 의 위치 ( 세포질체 ) 를 기록 하 였 고 , 후 에 융합 의 시작 까지 T 10 방울 에서 입체 현미경 하 에서 수집 하 였 다 .