스트레스 조건 하 에서 crtNM 유전자 의 발현 수준 을 분석 하 기 위해 , L . pentosus KCCP 11226 세포 를 7 mM H 2 O 2 또는 7 %( w / v ) NaCl 을 포함 하 는 MRS 배지 에서 30 ℃ 로 24 시간 동안 배양 하 였 다 . 대조 군 는 30 ℃ 에서 24 시간 동안 MRS 배지 에 배양 하 였 다 . RNeasy Protect Bacteria Mini Kit ( Qiagen , Hilden , Germany ) 및 Proteinase K 용액 ( Qiagen , Hilden , Germany ) 을 사용 하 여 위 의 조건 에서 배양 된 L . pentosus 세포 에서 총 박테리아 RNA 를 추출 하 였 다 . 총 RNA 는 각 배양 조건 에서 L . pentosus 의 세 가지 독립 적 인 세포 배 양물 로부터 추출 되 었 다 . RNA 농도 는 Nanodrop ( Thermo Scientific , MA , USA ) 을 사용 하 여 260 nm 에서 측정 하 였 다 . 순도 는 260 / 280 nm 비율 을 결정 함 으로써 확인 되 었 다 . cDNA 를 합성 하 기 위해 0 . 1 μ g total RNA 를 사용 하 였 다 . Diastar RT Kit ( Solgent , Seoul , Korea ) 와 random hexamers ( Neoprobe , Daejeon , Korea ) 를 이용 하 여 RT - PCR 을 수행 하 였 다 . qRT - PCR 은 SYBR Green real - time PCR Master Mix ( TOYOBO , Osaka , Japan ) 와 StepOnePlus Real - Time PCR System ( Applied Biosystems , Foster City , CA , USA ) 을 사용 하 여 수행 되 었 다 . crtN 유전자 를 증폭 하 기 위해 프라이머 세트 RT - crtN - for ( 5 '- ACCGAAGCATTACACACGATCC - 3 ') 및 RT - crtN - rev ( 5 '- TCAGGAACTGGTACTAAAACAT - 3 ') 를 사용 하 여 179 bp 의 amplicon 을 생성 시켰 다 . crtM 유전자 를 증폭 하 기 위해 프라이머 세트 RT - crtM - for ( 5 '- GCATTGCGCCAATCATTGAC - 3 ') 및 RT - crtM - rev ( 5 '- GCGGGTTAGTTGCTAGCATT - 3 ') 를 사용 하 여 247 bp 의 amplicon 을 생성 시켰 다 . L . pentosus 16 S rRNA housekeeping 유전자 는 다음 의 범용 프라이머 로 증폭 시켰으며 194 bp 의 amplicon 을 생성 시켰 다 ; 341 F ( 5 '- CCTACGGGAGGCAGCAG 3 ') 및 518 R ( 5 '- ATTACCGCGGCTGCTGG - 3 '). 사용 된 PCR 조건 은 다음 과 같 다 : 95 ℃ 에서 15 분 ; 이어서 95 ℃ 에서 20 초 , 55 ℃ 에서 40 초 , 72 ℃ 에서 30 초 의 30 사이클 을 수행 하 였 다 . 용융 프로그램 은 95 ℃ 에서 15 초 , 55 ℃ 에서 1 분 , 및 95 ℃ 에서 15 초 수행 하 였 다 . 클로닝 은 증폭 된 카로티노이드 생합성 유전자 의 수 를 정량 화 하 기 위하 여 수행 되 었 다 . DNA 추출 후 Solg 2 x EF - Taq PCR Smart Mix 2 ( Solgent , Seoul , Korea ) 를 이용 하 여 PCR 을 수행 하 였 다 . PCR 은 Solg 2 X EF - Taq PCR Smart Mix 2 ( Solgent , Seoul , Korea ) 10 μ L , 각 primer ( 10 pmol ) 1 μ L , 멸균 증류수 7 μ L 및 총 DNA 1 μ L 를 포함 하 는 20 μ L 부피 로 수행 되 었 다 . PCR 조건 은 다음 과 같 다 : 95 ℃ 에서 5 분 ; 95 ℃ 에서 30 초 , 55 ℃ 에서 30 초 , 72 ℃ 에서 30 초 의 30 사이클 ; 이어서 72 ℃ 에서 5 분 . PCR 산물 을 QIAquick Gel Extraction Kit ( Qiagen , Hilden , Germany ) 를 사용 하 여 정제 하 고 pGEM - T easy 벡터 ( Promega , Madison , WI , USA ) 에 클로닝 하 였 다 . Hit - DH 5 α Value 108 ( RBC Bioscience , Taipei , Taiwan ) 을 형질 전환 을 위한 숙주 균주 로 선택 하 고 실험 에 사용 했 다 . 재조합 된 Escherichia coli 를 100 μ g / mL 암피실린 ( Sigma Aldrich , St . Louis , MO , USA ) 을 첨가 하 여 37 ℃ 에서 LB 배지 에서 배양 하 였 다 . 복제 된 플라스미드 를 제조자 의 지시 에 따라 QIAprep Spin Miniprep Kit ( Qiagen , Hilden , Germany ) 를 사용 하 여 추출 하 였 다 . 정량화 를 위해 16 S rRNA 유전자 , L . pentosus KCCP 11226 의 crtN 유전자 및 crtM 유전자 를 포함 하 는 pGEM - T Easy 벡터 를 희석 하 여 표준 곡선 을 구성 하 였 다 . Quanti - iT PicoGreen dsDNA 시약 ( Invitrogen , Carlsbad , CA ) 을 사용 하 여 플라스미드 의 농도 를 확인 하 였 다 . 준비 된 표준 곡선 을 사용 하 여 qRT - PCR 에 의해 crtN 및 crtM 을 정량 화 하 였 다 . 복제 수 는 다음 방정식 을 사용 하 여 결정 되 었 다 :