멜 란 - A 세포주 ( ( 주 ) 태평양 피부 연구소 ) 를 10 % 소 태반 혈청 ( Fetal Bovine Serum , Gibco , Invitrogen , USA ) 과 200 nm 포볼 12 - 미리 스테이트 13 - 아세테이트 ( Phorbol 12 - Myristate 13 - Acetate , Sigma ) 를 첨가 ( supplement ) 한 RPMI 1640 배지 ( Gibco , Invitrogen , USA ) 에서 배양 하 였 다 . 100 π 세포 배양 접시 에 10 ㎖ 의 상기 배양액 을 넣 고 약 5 × 105 개 의 세포 를 접종 한 후 , 37 ℃, 5 % CO 2 환경 에서 3 ∼ 4 일 간 배양 하 였 다 . 세포 가 융합 하 여 생장 하 면 24 웰 플레이트 에 1 X 105 세포 / 웰 로 접종 하 고 다시 24 시간 동안 배양 하 였 다 . 매일 웰 당 990 ㎕ 의 배양액 을 갈아주 면서 실시 예 1 에서 얻 어 진 멍게 의 껍질 추출물 , 실시 예 2 에서 얻 어 진 멍게 의 껍질 추출물 ( 물 분획 물 ) , 및 PTU ( phenylthiourea ; 동경 화성 공업 주식회사 , 일본 ) 를 1 , 10 , 100 / ml 의 농도 가 되 도록 10 ㎕ 씩 3 일 간 처리 ( 용매 : 50 % 프로필렌 글리콜 , 30 % 에탄올 , 20 % 증류수 ) 한 후 다시 1 일 간 배양 하 였 다 . 멜라닌 생성 을 억제 하 는 것 으로 알려져 있 는 PTU 는 양성 대 조군 으로 사용 되 었 다 .