애기장대 CYP 78 A 6 와 CYP 78 A 9 유전자 에 T - DNA 가 삽입 된 돌연변이체 는 80 , 000 개 의 T - DNA 삽입 돌연변이 집단 ( 80 , 000 라인 x 식물 체당 평균 1 . 5 T - DNA 사본 = 약 120 , 000 T - DNA 삽입 ) 으로부터 역방향 유전학 을 통해 분리 하 였 다 . 본 연구 에 사용 된 T - DNA 삽입 돌연변이 집단 은 다음 과 같 다 : Feldmann 라인 ( 6 , 000 라인 ; Winkler et al . , 1998 . Plant Physiol 118 : 743 - 749 ) , Thomas Jack 라인 ( 6 , 000 라인 ; Campisi et al . , 1999 . Plant J 17 : 699 - 707 ) , Wisconsin 라인 ( Arabidopsis Knockout facility in Biotechnology Center of University of Wisconsin , 60 , 480 라인 ; Krysan et al . , 1999 . Plant Cell 11 : 2283 - 2290 ) . PCR 을 이용 한 역방향 유전학 은 기본 적 으로 Winkler 등 ( 1998 . Plant Physiol 118 : 743 - 749 ) 과 Krysan 등 ( 1999 . Plant Cell 11 : 2283 - 2290 ) 의 방법 에 따라 수행 하 였 다 . 상기 T - DNA 삽입 돌연변이 집단 의 DNA 풀로 부터 CYP 78 A 6 와 CYP 78 A 9 유전자 에 T - DNA 가 삽입 된 돌연변이체 를 분리 하 기 위하 여 T - DNA border 프라이머 와 각 유전자 특이 프라이머 의 조합 을 이용 하 여 PCR 을 수행 하 였 다 . PCR 조건 은 다음 과 같 다 ; 96 ° C , 5 분 ( 초기 변성 ) : 94 ° C , 15 초 - 65 ° C , 30 분 - 72 ° C , 2 분 ( 36 사이클 ) : 72 ° C , 5 분 ( 마지막 신장 단계 ) . PCR 산물 은 1 % 아가로스 겔 에서 전기영동 한 후 이 를 나일론 막 으로 전이 시키 고 , 특이 적 증폭 을 확인 하 기 위하 여 각 유전자 절편 을 방사성 동위 원소 ( 32 P ) 로 표지 하 여 Southern 혼성 화 반응 을 수행 하 였 다 . 혼 성 화 반응 이 일어난 절편 에 해당 하 는 PCR 산물 에 대해 시퀀싱 을 수행 하 여 각 유전자 상 의 T - DNA 삽입 위치 를 결정 하 였 다 . DNA 풀 에 상응 하 는 해당 번호 의 종자 를 발아 시키 고 , 잎 절편 으로부터 게놈 DNA 를 추출 한 후 T - DNA 삽입 이 확인 된 프라이머 조합 으로 PCR 을 수행 하 여 T - DNA 가 삽입 된 돌연변이체 를 분리 하 였 다 . 분리 된 돌연변이체 가 이 형 접합체 인지 상동 접합체 인지 의 여부 를 확인 하 기 위하 여 T - DNA border 와 유전자 특이 프라이머 및 정 방향 과 역방향 유전자 특이 프라이머 조합 으로 PCR 을 수행 하 였 다 .