이론 으로 결부 시키 고자 하 는 것 은 아니 지만 , CD 34 + HSPC 집단 은 생 착 , 자가 - 재생 및 세포 운명 에 대한 다양 한 잠재 성 의 세포 를 함유 하 는 것 으로 생각 되 며 , 이때 장기간 조혈 줄기세포 를 생 착시 키 는 것 을 포함 하 여 공유 된 특성 을 갖 는 세포 에서 부가 적 인 마커 를 추가 로 농화 시킨다 ( 문헌 [ Notta , Science , 2011 Jul 8 ; 333 ( 6039 ) : 218 - 21 . doi : 10 . 1126 / science . 1201219 ; Huntsman , 혈액 . 2015 Sep 24 ; 126 ( 13 ) : 1631 - 3 . doi : 10 . 1182 / 혈액 - 2015 - 07 - 660670 ] ; 각각 은 그 전체 가 참조 로 본 명세서 에 포함 됨 ) . 이론 으로 결부 시키 고자 하 는 것 은 아니 지만 , 이러 한 하위 집단 은 이식 - 후 상이 한 시기 에 조혈 시스템 을 재 구성 할 수 있 으므로 유전자 편집 된 세포 이식 에서 특정 한 치료 적 이득 일 수 있 다 . 따라서 , 세포 를 유세포 분석 받 게 하 여 , HSPC 하위 집단 에서 편집 효율 을 특징 화 하 였 다 . 5 개 세포 집단 을 단리 하 였으며 , 첫 번 째 는 CD 34 + 세포 이 었 으며 , 뒤 이 어 제시 된 전략 을 사용 하 여 CD 34 + CD 45 RA - CD 38 +, CD 34 + CD 45 RA - CD 38 - CD 90 - CD 49 f +, CD 34 + CD 45 RA - CD 38 - CD 90 + CD 49 f + 및 CD 34 + CD 45 RA - CD 38 - CD 90 - CD 49 f - 세포 에 대해 4 - 방식 소팅 이 었 다 ( 도 11 ) . 이 들 소팅 된 집단 을 각각 , HBG 1 및 HBG 2 표적 부위 국소 화 된 영역 을 개별 적 으로 시퀀싱 함 으로써 , 뿐 만 아니 라 개입 HBG 1 - HBG 2 영역 의 결실 의 검출 에 의해 편집 에 대해 분석 하 였 다 . HBG 1 - HBG 2 결실 ( 즉 , 절제 ) 빈도 는 하위 집단 에 걸쳐 69 내지 81 퍼센트 범위 로 일반 적 으로 높 았 다 ( 도 12 ) . 개별 적 으로 HBG 1 및 HBG 2 프로모터 에서 의 국소 화 된 증폭 및 NGS 를 사용 하 여 , 각각 의 부위 에서 편집 %( 소형 삽입 결실 ) 를 결정 하 였 다 . 두 프로모터 모두 에서 표적 화 함 으로써 유발 된 역위 또는 결실 을 갖 는 대립 유전자 는 검정 법 에서 증폭 되 지 않 을 것 이 다 . HBG 1 - HBG 2 결실 또는 역위 가 없 는 대립 유전자 중 에서 , 편집 은 하위 집단 에 걸쳐 , HBG 1 에 대해 53 내지 73 퍼센트 및 HBG 2 에 대해 75 내지 91 퍼센트 의 범위 로 유사 하 게 높 았 다 . HBG 1 - HBG 2 결실 된 게놈 의 퍼센트 를 HBG 2 에서 편집 을 갖 는 비 - HBG 1 - HBG 2 결실 된 게놈 의 퍼센트 와 조합 함 으로써 최소 총 편집 을 추정 하 였 다 ( 최소 총 편집 = % 결실 + % 비 결실 [ 100 - % 역위 를 무시 한 결실 ] x HBG 2 에서 % 편집 ) . HBG 1 에서 의 국소 화 된 소형 삽입 결실 은 포함 시키 지 않 았 는데 , 본 발명자 들 이 HBG 1 에서 의 % 편집 중 어느 정도 가 HBG 1 단독 으로 국소 화 된 삽입 결실 을 갖 는 대립 유전자 인지 , 어느 정도 가 HBG 1 과 HBG 2 둘 모두 에서 공존 삽입 결실 을 갖 는 대립 유전자 인지 결정 할 수 없 었 기 때문 이 다 . 최소 총 편집 은 하위 집단 에 걸쳐 92 내지 97 퍼센트 범위 인 것 으로 추정 되 었 다 . HBG 1 및 HBG 2 표적 부위 로 국소 화 된 삽입 결실 에 대한 편집 패턴 은 또한 , 하위 집단 에 걸쳐 유사 하 였으며 , 이때 가장 빈번 하 게 관찰 된 편집 패턴 은 하위 집단 에 걸쳐 보편 적 이 었 다 . 모든 하위 집단 및 각각 의 부위 HBG 1 또는 HBG 2 에 대해 , 상위 3 개 삽입 결실 패턴 은 6 bp 결실 , 5 bp 결실 및 1 bp 결실 을 포함 하 였 다 ( 도 13 a ( HBG 1 유전자좌 ) ; 도 13 b ( HBG 2 유전자좌 ) ) . 요약 하 자면 , 총 HSPC 와 정의 된 CD 34 + CD 45 RA - CD 38 - CD 90 + CD 49 f + 장기간 조혈 줄기세포 를 포함 하 여 하위 분획 사이 에서 일관 된 편집 빈도 및 패턴 은 HSPC 이식 에 대해 본원 에서 기재 된 유전자 편집 접근 법 의 유용 성 을 뒷받침 한다 .