B 16 F 10 을 6 - well plate 의 각 well 당 1 × 105 cells / well 로 접종 하 고 24 시간 배양 시킨 다음 , 배지 를 제거 하 고 혈청 이 포함 된 배지 ( a - MSH 50 nM ) 를 이용 하 여 시료 를 적당 한 농도 로 희석 하 여 각 well 에 넣 어 준 후 48 시간 추가 로 배양 하 였 다 . 세포 를 PBS 로 세척 하 고 trypsin - EDTA 0 . 5 ㎖ 을 처리 하 여 세포 를 떼 어 내 고 PBS 0 . 5 ㎖ 을 첨가 하 여 세포 를 회수 한 다음 , 회수 된 세포 는 10 , 000 rpm 으로 10 분 간 원심 분리 하 여 상등 액 을 제거 하 고 침전물 ( pellet ) 을 65 ℃ 에서 1 시간 정도 건조 시켰 다 . 여기 에 , 1 M NaOH 수용액 100 ㎕ 를 첨가 하 여 65 ℃ 에서 1 시간 정도 반응 시켜 세포내 의 멜라닌 을 얻 었 다 . 그 후 96 well plate 에 위 에서 얻 은 lysate 를 각각 100 ㎕ 씩 넣 어 준 후 , ELISA reader 로 490 nm 에서 흡광도 를 측정 하 여 멜라닌 함량 을 측정 하 였 다 . 이 를 다 시 각각 의 lysate 를 이용 하 여 BCA 법 으로 단백질 정량 을 하 여 단백질 양 에 대한 멜라닌 량 을 구하 고 Synthetic melanin ( SIGMA , M 0418 ) 을 이용 하 여 표준 곡선 을 구하 여 멜라닌 의 함량 을 정량 하 였 다 .