전형 적 으로 12 . 5 μ l 의 분석 완충제 를 분석 플레이트 의 B 열 내지 P 열 에 분배 하 였 다 . 분석 완충제 중 에 적절 하 게 희석 시킨 테스트 화합물 18 . 75 μ l 를 A 열 에 첨가 하 였 다 . 6 . 25 μ l 의 샘플 분취 물 을 A 열 로부터 B 열 로 옮기 고 , 샘플 을 피펫 으로 3 회 혼합 하 였 다 . 이 공정 을 플레이트 아래 에서 반복 하 고 , 혼합 후 N 열 에서 6 . 25 μ l 의 용액 을 버렸 다 . O 열 및 P 열 을 양성 및 음성 대 조군 으로 표기 하 였 다 . P 열 에 6 . 25 μ l 의 기본 완충제 를 첨가 하 였 다 . 기본 완충제 에 희석 시킨 6 . 25 μ l 의 효소 ( 신선 하 게 제조 한 40 nM BACE 1 또는 40 nM BACE 2 ) 를 A 열 내지 O 열 에 첨가 하 였 다 . 분석 을 시작 하 기 위하 여 , 6 . 25 μ l 의 신선 제조 80 μ M 기질 ( 100 % DMSO 용액 중 1 mM 을 HPLC 등급 물 ( 옵티마 ( Optima ) W 6 - 212 ; 서모 피셔 ) 내 에 희석 시킴 으로써 제조 함 ) 을 모든 웰 에 첨가 하 였 다 . 분석 플레이트 는 뚜껑 을 덮 고 37 ± 1 ℃ 에서 60 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 웰 당 9 회 판독 의 프로토콜 ( 50 ms 적분 ; 3 의 치밀도 , 0 . 25 mm 의 이 격치 ; 스펙 트라 맥스 패러다임 ( SpectraMAX Paradigm ) 플레이트 판독기 ; TUNE 카트리지 ; SoftMax Pro v 6 . 3 소프트웨어 ; 영국 버크셔 오킹엄 소재 의 몰레 큘라 디바 이시즈 유케 이 리 미티 드 ( Molecular Devices UK Ltd . ) ) 을 이용 하 고 , 상기 9 개 의 판독 치 의 중앙값 을 텍스트 파일 로 출력 하 여 , 360 / 405 nm ( 여기 / 방출 ) 에서 웰 의 형광 강도 를 판독 하 였 다 . 판매 회사 가 공급 하 는 비 선형 회귀 분석 모델 을 이용 하 여 , Prism 소프트웨어 v 6 . 3 ( 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 의 그래프 패드 인 크 . ( GraphPad Inc . ) ) 을 이용 하 여 데이터 분석 을 실시 하 였 다 . IC 50 결정 을 위하 여 , 4 파라미터 로지스틱 변수 기울기 모델 을 이용 하 여 미 가공 형광 강도 데이터 를 피팅 시켰으며 , 이때 ' 최 하위 ( bottom ) ' 는 음성 대 조군 에 대하 여 보정 하 였 다 .