하이브리도마 상청 액 의 스크리닝 . 직접 ELISA 또는 유세포 측정 분석 ( FACS ) 을 사용 하 여 제 1 면역 화 시리즈 로부터 의 하이브리도마 상청 액 의 1 차 스크리닝 을 행하 여 항 - NKG 2 D 특이 적 항체 의 존재 에 대하 여 테스트 하 였 다 . 간단히 말 해서 , maxisorp 플레이트 를 50 μ l 0 . 4 μ g / ml mFc - NKG 2 D ( 뮤 린 Fc 에 융합 되 고 CHO 세포 에서 발현 된 NKG 2 D 의 세 포외 부분 을 포함 ) 로 밤새 PBS 에서 4 ℃ 에서 코팅 한 다음 PBS , 0 . 05 % Tween 20 으로 15 분 동안 실온 에서 블로킹 함 으로써 ELISA 를 행하 였 다 . 이어서 플레이트 를 50 μ l 하이브리도마 상청 액 과 함께 인 큐 베이 션 하 고 , 산양 - 항 - 사람 IgG - HRP Fc γ 절편 특이 적 ( Jackson , 109 - 036 - 098 ) 을 사용 하 여 NKG 2 D - 특이 적 항체 를 검출 하 였 다 . 이 들 인 큐 베이 션 을 1 시간 동안 실온 에서 행하 고 , 각 단계 사이 에 플레이트 를 PBS , 0 . 05 % Tween 20 으로 세정 하 였 다 . 10 O μ l TMB 기질 ( Kem - En - Tec ) 을 사용 하 여 결합 된 항체 를 시각 화 하 고 , 4 M H 3 PO 4 으로 정지 하 였 다 . 플레이트 를 450 및 620 nm 에서 판독 하 였 다 . FACS 를 위해서 , 50000 세포 를 10 μ l 에서 90 μ l 하이브리도마 상청 액 과 함께 30 분 동안 4 ℃ 에서 인 큐 베이 션 한 후 , PBS 로 2 % FCS 와 함께 세정 하 고 , 이어서 2 차 산양 - 항 - 사람 IgG - HRP Fc γ 절편 특이 적 ( Jackson , 109 - 036 - 098 ) 과 함께 인 큐 베이 션 하 여 NKG 2 D - 발현 BaF / 3 세포 및 NKG 2 D 를 발현 하 지 않 는 대 조군 BaF / 3 세포 에 대한 결합 을 분석 하 였 다 . 그 다음 세포 를 B & D FACSArray ( BD Biosciences ) 에서 분석 하 였 다 . NKG 2 D - 발현 BaF / 3 세포 만 을 착색 하 고 대 조군 세포 는 그렇 지 않 은 항체 를 NKG 2 D - 특이 적 으로 간주 하 였 다 .