RNAi 검정 - MG 53 의 shRNA 녹다운 을 위한 표적 서열 은 마우스 MG 53 cDNA 내 의 위치 622 - 642 ( GAG CTG TCA AGC CTG AAC TCT ) 에 존재 한다 . 카베 올린 - 3 에 대해 , 표적 서열 은 위치 363 - 380 ( GAC ATT CAC TGC AAG GAG ATA ) 에 존재 한다 . 상보 적 센스 및 안티 센스 올리 고 누 클레오 티 드 를 합성 하 였 다 . MG 53 shRNA 및 대 조군 플라스미드 를 작 제 하 기 위해 , 어닐링 된 올리 고누 클레오 티 드 를 Acc 65Ⅰ / Hind Ⅲ 제한 효소 부위 에서 psiRNA - hHlGFPzeo G 2 ( InvivoGene ) 로 삽입 하 였 다 . 카베 올린 - 3 shRNA 및 대조 플라스미드 를 위해 , 어닐링 된 올리 고누 클레오 티 드 를 EcoR Ⅰ / BamH Ⅰ 제한 효소 부위 에서 pRNAiDsRed 벡터 ( BD Biosciences ) 로 삽입 하 였 다 . 각각 의 벡터 는 세포 트랜스펙션 의 마커 로 작용 하 는 독립 적 인 형광 단백질 발현 카세트 ( 녹색 또는 적색 ) 을 갖 는다 . 모든 플라스미드 를 플 랭킹 프라이머 를 이용 한 직접 서열 분석 에 의해 확인 하 였 고 , MG 53 및 카베 올린 - 3 단백질 발현 의 하향조절 을 웨스턴 블롯 분석 에 의해 시험 하 였 다 .