H 5 - VN 04 HA 유전자 의 엑 토 도메인 을 상기 6 기재 된 프로토콜 을 변형 시켜 곤충 세포 에서 융합 단백질 로서 발현 시켰 다 . 이러 한 제작물 은 트리 메릭 구조 를 안정 화 시키 기 위한 박테리오파지 T 4 피 브리 틴 으로부터 의 C - 말단 트 라이머 화 ' 폴 돈 ' 서열 , 이어서 트롬빈 부위 및 His 6 태그 를 함유 한다 . 융합 단백질 의 cDNA 를 바 큘로바이러스 전달 벡터 인 pAcGP 67 A ( BD 바이오 사이언 시즈 , 매사추세츠 주 베드포드 소재 ) 내 로 클로닝 하 여 재조합 단백질 의 효율 적 인 선별 을 가능 케 하 였 다 . 완전히 절단 된 HA 를 ( HA 1 - HA 2 트 라이머 로서 ) 수득 하 기 위해 , sf 9 세포 를 실험 적 으로 유래 된 비율 의 HA 0 및 푸린 의 바 큘로바이러스 스탁 으로 동시 감염 시켰 다 . 푸린 cDNA 는 로버트 풀러 박사 ( Dr . Robert Fuller ) ( 유니 버시 티 오브 미 시간 ( University of Michigan ) ) 으로부터 증정 되 었 다 . 감염 3 일 후 , 세포 를 스핀 다운 시키 고 , 상등 액 을 Ni - NTA 비드 ( 키아 젠 인 크 . , 캘리포니아주 발렌시아 소재 ) 와 함께 인 큐 베이 션 하 였 다 . 비드 를 10 mM 이미다졸 함유 TBS 완충액 ( 10 mM 트리스 . HCl , 80 mM NaCl , pH 8 . 0 ) 으로 세척 하 고 , 250 mM 이미다졸 함유 TBS 로 용출 시켰 다 . 용출 된 H 5 단백질 을 TBS 완충액 에 대해 투석 하 고 , 모노 Q HR 10 / 10 컬럼 ( 지이 헬스 케 어 , 뉴저지주 피스 카타 웨이 소재 ) 을 사용 하 는 이온 - 교환 에 의해 추가 로 정제 하 였 다 . 정제 된 H 5 를 밤새 트롬빈 에 의해 소화 시키 고 , TBS 완충액 에서 슈퍼 덱스 200 컬럼 에 의해 추가 로 정제 하 였 다 .