본 발명자 들 은 재조합 인간 EPO 단백질 의 EMT 억제 효과 를 확인 하 고자 재조합 인간 EPO 단백질 의 처리 에 따른 상피 세포 및 세 포외 기질 표현 형 마커 의 발현 변화 를 비교 하 였 다 . 상피 세포 표현 형 마커 로 는 ZO - 1 및 E - 카드 헤 린 ( E - cadherin ) 을 사용 하 였 고 세 포외 기질 표현 형 마커 로 는 라미닌 을 이용 하 였 다 . 신장 섬유증 마우스 는 상기 실시 예 < 1 - 1 > 과 동일 한 방법 으로 제조 하 였 고 각 실험 군 및 대 조군 은 상기 실시 예 < 2 - 1 > 과 동일 한 방법 으로 다섯 그룹 으로 분류 하 였 다 . 신장 섬유증 마우스 및 가장 수술 한 대 조군 마우스 를 수술 후 3 일 과 14 일 째 에 엔 플 루란 ( enflurane ) 흡입 마취 를 통하 여 안락사 시켰 다 . 안락사 한 마우스 로부터 수득 한 신장 을 고정액 ( 0 . 1 mol / L 카코딜 산염 완충액 ( pH 7 . 4 ) 에 4 % 파라포름 알데하이드 ( paraformaldehyde ) 를 첨가 함 ) 에 침지 시킨 후 파라핀 에 넣 어 고정 하 고 회전식 마이크로톰 ( Leica , 독일 ) 을 사용 하 여 3 ㎛ 두께 로 세절 함 으로서 조직 절편 을 제조 하 여 확인 하 였 다 . 상기 조직 절편 을 0 . 1 % BSA , 0 . 3 % 트리톤 X - 100 이 포함 된 PBS 로 희석 한 각각 의 ZO - 1 항체 ( Santa cruz Biotechnology , 미국 ) , 라미닌 항체 ( R & D systems , 미국 ) 및 E - 카드 헤 린 항체 ( R & D systems , 미국 ) 와 함께 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 반응 시켰 다 . 상기 일 차 항체 로 처리 된 절편 을 이 차 형광 항체 ( 염소 항 토끼 IgG , Alexa Fluor 488 및 염소 항 마우스 IgG , Alexa Fluor 594 , Molecular Probes Inc , Eugene , OR ) 와 1 시간 동안 반응 시켰 다 . 상기 조직 절편 에 항 - 페이딩 시약 ( n - propylgallat , P - 3101 , Sigma , 미국 ) 을 함유 한 친수성 봉입 용 배지 를 첨가 하 고 커버 슬립 으로 봉입 한 후 형광 현미경 ( Carl Zeiss , 독일 ) 으로 관찰 하 였 다 . ZO - 1 은 녹색 을 나타내 며 , 라미닌 및 E - 카드 헤 린 은 붉 은 색 을 나타낸다 .