이 를 위해 인간 유래 KIAA 0317 의 HECT 영역 ( KIAA 0317 - H ) 또는 HECT 영역 의 720 번 째 시스테인 잔기 가 알라닌 잔기 로 치환 된 HECT ( KIAA 0317 - Hc / a ) 영역 을 코딩 하 는 서열 을 pGEX 5 X - 3 ( Pharmacia , USA ) 에 제조자 의 권고 대로 클로닝 하 여 , 각각 GST ( Glutathione S trnasferase ) 와 융합 된 GST - KIAA 0317 - H 및 GST - KIAA 0317 - Hc / a 벡터 를 제작 하 여 E . coli ( BL 21 ) 에서 발현 하 고 정제 하 였 다 . 동 단백질 을 E 1 ( Calbiocem , USA ) 및 E 2 ( Calbiocem , USA ) 의 존재 중 에서 유비퀴틴 및 ATP 와 25 ℃ 에서 90 분 간 반응 시켰 다 . 반응 후 , 상기 혼합물 을 완충액 으로 세척 하 여 여분 의 유비퀴틴 을 제거 한 후 , 공지 의 방법 대로 , 12 % 의 SDS ( Sodium Dodecy Sulfate ) - 폴리 아크릴아미드 젤 전기영동 ( PAGE ) 을 하 여 , 나일론 막 에 전달 한 후 , 1 차 항체 로서 , 항 - 유비퀴틴 ( Santa Cruze Biotechnology USA ) 및 항 - GST 항체 ( Pharmingen , USA ) , 및 2 차 항체 로서 항 - 염소 - 호스 레디 쉬 과산화 효소 - 융합 항체 및 Chemiluminescence Detect Kit ( Amersham , UK ) 을 공지 의 방법 및 제조자 의 권고 대로 사용 하 여 웨스턴 블롯 을 수행 하 였 다 .