모든 측정 을 기질 로서 글루 타미 닐 - 7 - 아미노 - 4 - 메틸 코우 마린 ( H - Gln - AMC ) 및 보조 효소 로서 재조합 피 로 글루 타밀 아미노 펩 티 다제 ( pGAP ) 를 사용 하 여 EnSpire Perkin Elmer 다중 방식 판독기 ( multimode reader ) 로 수행 하 였 다 . 반응 을 주위 온도 에서 블랙 96 - 웰 반 영역 마이크 로 플레이트 ( black 96 - well half area microplate ) 에서 수행 하 였 다 . 각각 의 샘플 은 1 μ l 의 시험 화합물 용액 또는 용매 ( DMSO ) 및 검정 완충액 ( 50 mM 트리스 / HCI , pH 8 . 0 또는 50 mM MES 완충액 , pH = 6 . 0 ) 속 에 적절 하 게 희석 된 49 μ l 의 QC 로 이루 어 졌 다 . 주위 온도 에서 10 분 의 예비 항온 처리 후 효소 반응 을 검정 완충액 속 에 50 μ l 의 Gln - AMC - 기질 / pGAP 혼합물 을 가함 으로써 시작 하 였 다 . 최종 기질 농도 는 pH 8 . 0 또는 6 . 0 에서 의 측정 에서 각각 50 및 200 μΜ 이 었 다 . 형광 성 AMC 의 방출 은 380 / 460 nm 의 여기 / 방출 파장 에서 기록 하 였 다 . 효소 반응 의 초기 속도 는 Enspire Manager 소프트웨어 를 사용 하 여 처음 10 개 데 이타 점 의 선형 회귀 로 계산 하 였 다 . IC 50 의 최종 적 인 평가 및 계산 을 GraphPad Prism 소프트웨어 를 사용 하 여 수행 하 였 다 . IC 50 값 을 정규 화 된 데 이타 ( 억제제 의 부 재하 에서 QC 활성 = 100 %) 로부터 4 - 매개변수 로지스틱 방정식 에 따라서 비 선형 회귀 에 의해 계산 하 였 다 . Ki - 값 을 다음 의 식 에 따라 계산 하 였 다 : Ki = IC 50 / ( 1 +[ S ] / Km ) , 여기 서 : [ S ] 는 검정 시 기질 의 농도 를 반영 하 며 ( pH 6 . 0 의 경우 200 μΜ , pH 8 . 0 의 경우 50 μΜ ) Km 은 각각 의 미카엘리스 - 멘 텐 상수 ( Michaelis - Menten constant ) ( pH 6 . 0 에서 390 μΜ , pH 8 . 0 에서 62 μΜ ) 이 다 .