먼저 , - 80 ℃ 의 deep freezer 에 보관 되 어 있 던 스탁 셀 ( stock cell ) 을 녹인 후 kanamycin 과 spectinomycin 이 첨가 된 BHIS 평판 배지 ( 조성 은 37 g / L Brain Heart Infusion ( BHI ) , 91 g / L sorbitol , 15 g / L agar ) 에 스프 레 딩 하 여 30 ℃ 에서 48 시간 배양 하 였 다 . 이후 fresh colony 를 50 mL Falcon tube 안 에 5 mL 의 BHIS 배지 ( 조성 은 37 g / L Brain Heart Infusion ( BHI ) , 91 g / L sorbitol ) 에 접종 한 후 16 ~ 24 시간 동안 30 ℃ 에서 배양 하 였 다 . 전 배양액 은 4 개 의 250 mL 배 플 플라스크 ( 발효기 시드 ) 에 각각 50 mL 의 CGXII 배지 ( CGXII 배지 : 20 g / L ( NH 4 ) 2 SO 4 , 5 g / L urea , 1 g / L KH 2 PO 4 , 1 g / L K 2 HPO 4 , 0 . 25 g / L MgSO 4 · 7 H 2 O , 42 g / L 3 - morpholinopropanesulfonic acid ( MOPS ) , 13 mg / L CaCl 2 · 2 H 2 O , 10 mg / L FeSO 4 · 7 H 2 O , 14 mg / L MnSO 4 · 5 H 2 O , 1 mg / L ZnSO 4 · 7 H 2 O , 0 . 3 mg / L CuSO 4 · 5 H 2 O , 0 . 02 mg / L NiCl 2 · 6 H 2 O , 0 . 5 mg / L biotin , 30 mg / L protocatechuic acid and 0 . 5 mg / L thiamine ) 에 1 mL 을 접종 하 였 고 200 rpm 의 쉐 이킹 인큐베이터 ( shaking incubator ) 에 30 ℃ 에서 24 시간 배양 하 였 다 . 이때 CGXII 배지 에 초기 글리세롤 농도 는 40 g / L 로 설정 하 였 고 yeast extract 를 10 g / L 추가 하 였으며 MOPS 는 제외 하 였 다 . 다음 으로 , 총 200 mL 의 전배 양액 은 1 . 8 L 의 CGXII 발효 배지 ( 총 부피 6 L 발효기 ) 에 접종 하 였으며 ( 시작 OD 600 = 5 . 0 - 6 . 0 ) 시작 포도당 은 80 g / L 를 첨가 하 였 고 L - tryptophan 10 mg / L 를 추가 하 였으며 MOPS 는 제외 하 였 다 . 또한 MgSO 4 - 7 H 2 O , biotin , thiamine , protocatechuic acid , kanamycin , spectinomycin 은 따로 필터링 을 통해 제작 한 후 첨가 하 였 다 . 또한 1 mM 의 IPTG 는 최소 13 시간 이 지난 OD 600 >= 40 일 때 처리 되 었 다 .