변형 된 TRP 1 및 ADE 2 게놈 카세트 의 어셈블리 . ADE 2 ( ADE 2 - Off 1 , ADE 2 - Off 2 , ADE 2 - Off 3 및 ADE 2 - Off 4 ) 및 TRP 1 ( TRP 1 - On ) 게놈 로커스 를 조작 하 는 데 사용 된 DNA 카세트 를 유사 한 전략 을 사용 하 여 수립 하 였 다 . 2 가지 상이 한 콜로니 PCR 을 수행 하 여 각각 의 야생형 로커스 의 2 개 의 반 을 별개 로 증폭 시켰 다 . 첫 번 째 것 은 유전자 CDS 의 상류 의 정 방향 프라이머 및 각각 KpnI 또는 BamHI 제한 부위 에 이어진 on - 또는 off 1 - 4 - 타 겟 서열 을 함유 하 는 역방향 오버행 프라이머 를 채용 하 였 다 ( 부록 표 3 참조 ) . 모든 역방향 프라이머 는 단백질 의 말단 절단 을 보장 하 기 위해 온 / 오프 - 타 겟 서열 앞 에 정지 코돈 을 함유 하 였 다 . 카세트 의 두 번 째 반 을 ADE 2 및 TRP 1 코딩 서열 의 하류 를 어닐링 하 는 역방향 프라이머 및 카세트 의 첫 번 째 반 을 수립 하 는 데 사용 된 역방향 프라이머 앞 의 100 bp 를 어닐링 하 는 정 방향 프라이머 를 사용 하 여 어셈블리 하 였 다 . 이러 한 방식 에서 , 2 개 의 부분 이 함께 연결 된 경우 , 최종 구축물 은 온 -/ 오프 - 타 겟 서열 의 상류 및 하류 에 100 bp 길 이 상동성 영역 을 함유 하 였 다 . 또한 , 이 들 정 방향 프라이머 는 카세트 의 상응 하 는 첫 번 째 반 의 역방향 프라이머 에 존재 하 는 동일 한 제한 부위 를 함유 하 였 다 . TRP 1 및 ADE 2 단편 을 그 에 따라 KpnI 또는 BamHI ( 뉴 잉글랜드 바이오 랩스 ) 로 소화 된 2 개 의 반 을 라 이게 이 션 함 으로써 어셈블리 하 였 다 . 산물 을 아가로스 겔 상 에서 분리 하 여 호모 라 이게 이 션 - 유래 된 단편 을 제거 하 였 다 . 최종 카세트 를 가장 외부 프라이머 를 사용 하 여 PCR 에 의해 풍부 화 하 고 , 효모 에서 직접 적 으로 형질 전환 시켰 다 .