이어서 , 0 . 275 M Ca ( NO 3 ) 2 용액 10 mL 를 첨가 하 고 완전히 , 하지만 부드럽 게 혼합 하 였 다 . 800 rpm 에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 원형질체 를 수거 하 고 , 9 M 배양 배지 에 ml 당 0 . 5 x 106 의 밀도 로 재현 탁 시키 고 , 4 cm 직경 의 페트리 디쉬 로 옮기 고 , 동일 한 부피 의 2 % 알기 네이트 용액 ( 20 g / l Alginate - Na ( Sigma - Aldrich # A 0682 ) , 0 . 14 g / l CaCl 2 . 2 H 2 O , 90 g / l 만니톨 ) 을 첨가 하 였 다 . 이어서 , 1 ml 분취 량 ( 125000 형질 감염 된 원형질체 ) 을 Ca - Agar 플레이트 ( 72 . 5 g / l 만니톨 , 7 . 35 g / l CaCl 2 . 2 H 2 O , 8 g / l 한 천 , pH 5 . 8 ) 에 스프 래 딩 하 고 , 1 시간 동안 중합 시켰 다 . 플라스미드 구조 체가 트랜스펙션 에 사용 되 었 을 때 , 매립 된 원형질체 는 4 ml 의 K 8 p ( Kao , 1975 ) 배양 배지 를 함유 하 는 4 cm 조직 배양 접시 에서 성장 시켰 다 . 융합 단백질 이 트랜스펙션 에 사용 되 었 을 때 , " 본 발명자 들 은 트랜스펙션 되 지 않 았 지만 상기 와 동일 한 프로토콜 을 사용 하 여 알 기 네이트 에 매립 된 200000 토마토 원형질체 ( Moneyberg 품종 ) 를 함유 하 는 "" 피더 ( feeder ) "" 디스크 를 생성 함 으로써 원형질체 생존 을 개선 시켰 다 . 이어서 ", 트랜스펙션 된 원형질체 의 단일 디스크 를 4 ml 의 K 8 p ( Kao , 1975 ) 배양 배지 를 함유 하 는 4 cm 조직 배양 접시 에서 원형질체 의 단일 피더 디스크 와 조합 하 였 다 . 토마토 원형질체 에서 인 델 ( indels ) 을 검출 하 기 위해 , 트랜스펙션 된 원형질체 의 디스크 를 48 시간 후 에 접시 에서 제거 하 고 , 알기 네이트 를 용해 시키 고 , 원형질체 를 분리 하 였 다 . 캘리 의 재생 을 위해 , 원형질체 는 어두운 곳 에서 28 ℃ 에서 21 일 동안 K 8 p 배지 에서 배양 되 었 다 . 이 기간 후 , 형질 감염 된 원형질체 의 디스크 를 1 mg . l - 1 제나 틴 및 0 . 2 mg . l - 1 GA 3 가 보충 된 고체 GM 배지 ( Tan , 1987 ) 로 옮기 고 , 추가 3 주 동안 성장 시켰으며 , 이 시점 에서 캘리 는 대략 크기 가 0 . 3 mm 이 었 다 . 이어서 , 알기 네이트 를 용해 시키 고 , 캘리 를 GM 배지 의 신선 한 플레이트 에 스프 래 딩 하 고 , 대략 1 . 5 mm 가 될 때 까지 자라 게 하 였 고 , 이 시점 에서 다시 한 번 새로운 배지 로 옮기 고 , 추가 14 일 후 에 제노 타입 핑 되 었 다 .