업데이트 된 삼중 플라스미드 형질 감염 ( triple plasmid transfection ) 프로토콜 을 이용 하 여 재조합 AAV 벡터 를 생성 했 다 . 구체 적 으로 , 형질 감염 된 플라스미드 는 ( i ) 캡시드 - 특이 적 pXR 헬퍼 플라스미드 ( 즉 , 본 연구 에서 이용 된 다양 한 키메라 Cap 유전자 를 코딩 하 는 pXR 1 , pXRrh . 10 , 또는 다양 한 플라스미드 ) , ( ii ) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pXX 680 , 및 ( iii ) 각각 AAV 2 게놈 으로부터 유래 된 역전 TR ( terminal repeat ) 에 의해 플 랭킹 된 , CBh ( chicken beta actin hybrid ) 프로모터 에 의해 구동 되 는 자기 - 상보 적 ( self - complementary ) GFP ( green fluorescent protein ) 또는 CBA ( chicken beta actin ) 프로모터 에 의해 구동 되 는 Luc ( luciferase reporter transgene ) 을 코딩 하 는 ) pTR - CBh - scGFP 또는 pTR - CBA - Luc 플라스미드 를 포함 한다 . 이 오 딕 산 올 밀도 구배 초 원심 분리 ( iodixanol density gradient ultracentrifugation ) 를 이용 하 여 바이러스 벡터 를 정제 했 다 . CBh - scGFP 형질전환 유전자 를 패 키 징 하 는 벡터 를 뒤이 어 완충액 교환 및 Sartorius Vivaspin 2 100 kDa 분자량 컷 - 오프 ( MWCO ) 원심 분리 컬럼 ( F - 2731 - 100 Bioexpress , Kaysville , UT ) 을 이용 한 농축 에 적용 시켰 다 . CBA - Luc 형질전환 유전자 를 패 키 징 하 는 벡터 에 완충액 교환 및 Zeba Spin Desalting Columns , 40 K MWCO ( Thermo Scientific , Cat # 87770 ) 을 이용 한 탈염 ( de - salting ) 을 수행 했 다 . 정제 후 에 , Roche Lightcycler 480 ( Roche Applied Sciences , Pleasanton , CA ) 를 이용 한 정량 적 PCR 을 통해 바이러스 게놈 역가 ( titer ) 를 결정 했 다 . 특이 적 으로 AAV 2 역전 말단 반복부 ( inverted terminal repeat ) 를 인식 하 도록 정량 적 PCR 프라이머 를 설계 했 다 ( 정 방향 , 5 '- AACATGCTACGCAGAGAGGGAGTGG - 3 '; ( 서열 번호 36 ) 역방향 , 5 '- C A T G AGACAAGGAACCCCTAGTGATGGAG - 3 ') ( 서열 번호 37 ) ( IDT Technologies , Ames IA ) .