h 5 F 1 M 의 각각 의 V 유전자 를 엔지니어 링 하 기 위해 , 적어도 18 개 의 뉴클레오티드 의 오버랩 핑 영역 을 순차 적 으로 공유 하 는 , 길이 로 55 - 70 개 염기 의 4 쌍 의 올리 고 뉴클레오티드 를 합성 하 였 다 ( 표 8 . 중쇄 에 대해 : H 1 - H 8 , 경쇄 에 대해 : L 1 - L 8 ) . 전체 V 유전자 의 어셈블리 및 증폭 을 4 단계 로 수행 하 였 다 : 1 ) 4 쌍 의 상보 적 올리 고 뉴클레오티드 ( 중쇄 에 대해 : H 1 / H 2 , H 3 / H 4 , H 5 / H 6 및 H 7 / H 8 ; 경쇄 에 대해 : L 1 / L 2 , L 3 / L 4 , L 5 / L 6 및 L 7 / L 8 ) 를 담금질 하 였 고 , 3 ' 휴지 영역 을 개별 반응 에서 Klenow 단편 으로 채워서 4 개 의 이중 가닥 DNA ( dsDNA ) 단편 을 만드 는 단계 ; 2 ) 결과 된 4 개 의 dsDNA 단편 을 쌍 으로 혼합 하 고 , 변성 시키 고 , 재 - 담금질 하 고 , 3 ' 휴지 를 2 개 의 개별 반응 으로 채워서 2 개 의 dsDNA 단편 을 만드 는 단계 ; 3 ) 결과 된 2 개 의 dsDNA 단편 을 혼합 하 고 , 변성 시키 고 , 재 - 담금질 하 고 , 3 ' 휴지 를 채워서 전장 dsDNA 를 만드 는 단계 ; 및 4 ) XbaI 자리 를 함유 하 는 2 개 의 외부 프라이머 ( 중쇄 에 대해 : A 10 및 A 11 , 경쇄 에 대해 : A 12 및 A 13 ) 와 PCR 반응 ( 표 8 ) 을 그 후 조립 된 VL 및 VH 단편 을 증폭 하 기 위해 사용 하 는 단계 .