게놈 - 범위 수준 에서 의 evoCas 9 오프 - 타 겟 활성 의 분석 은 이전 에 확립 된 GUIDE - seq 기법 ( Tsai SQ et al . , Nat Biotechnol . 2015 , 33 ( 2 ) : 187 - 97 ) 을 사용 함 으로써 확장 되 었 다 . 이러 한 접근 법 은 라이브러리 제조 및 차세대 시퀀싱 에 대한 그 들 의 포착 을 허용 하 기 위한 Cas 9 에 의해 커팅 된 부위 내로 의 34 bp 올리 고 뉴클레오티드 태그 의 통합 에 기반 한다 . 이러 한 방식 에서 , Cas 9 에 의해 비 특이 적 으로 타 겟 팅 된 특정 한 가이드 RNA 와 연관 된 신규 한 게놈 부위 의 수집 을 비 편향 된 방식 으로 확인 하 는 것 이 가능 하 다 . GUIDE - seq 분석 을 수행 하 여 고도 로 반복 적 이 고 , 세포 게놈 내 로 다수 의 원 하 지 않 는 절단 을 생성 하 는 것 으로 제시 된 VEGFA 부위 2 로커스 의 에디 팅 과 연관 된 오프 - 타 겟 부위 를 분석 하 였 다 . 추가 적 으로 , 과거 의 보고 ( Kleinstiver BP et al . , Nature . 2016 , 529 ( 7587 ) : 490 - 5 ) 는 검출 된 오프 - 타 겟 의 일부 가 고 - 충실 도 SpCas 9 - HF 1 변이체 에 의해 여전히 절단 되 었 음 을 나타내 었 다 . 따라서 , GUIDE - seq 라이브러리 를 VEGFA 부위 2 sgRNA 및 미끼 이중 가닥 올리 고 뉴클레오티드 와 함께 야생 형 SpCas 9 또는 evoCas 9 중 어느 하나 로 형질 감염 된 293 T 세포 의 게놈 DNA 로부터 생성 하 였 다 . 시퀀싱 데이터 를 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인 을 사용 하 여 분석 하 였으며 ( Tsai SQ et al . , Nat Biotechnol . 2016 , 34 ( 5 ) : 483 ) , 이 는 온 - 타 겟 서열 과 7 개 이하 의 미스 매치 를 특징 으로 하 는 야생 형 SpCas 9 에 대한 600 개 의 상이 한 오프 - 타 겟 부위 를 밝혀 내 었 다 ( 도 10 a 및 10 b ) . 주목 할 만 하 게 는 , 이 들 오프 - 타 겟 서열 중 대략 100 개 는 각각 의 특이 적 부위 에서 의 실제 절단 활성 의 양호 한 프록시 인 것 으로 보 고 된 GUIDE - seq 분석 후 에 얻 어 진 리드 의 수 에 따라 , 온 - 타 겟 부위 가 보다 효율 적 으로 에디 팅 되 었 다 ( Tsai SQ et al . , Nat Biotechnol . 2015 , 33 ( 2 ) : 187 - 97 ) ( 도 10 a ) . 동일 한 분석 을 evoCas 9 샘플 에 대해 수행 한 경우 , 총 단지 10 개 의 부위 가 검출 되 었 으며 , 이 들 중 대다수 는 온 - 타 겟 과 높 은 유사 성 을 공유 하 였 고 , VEGFA 부위 2 로커스 와 5 개 미만 의 미스 매치 를 특징 으로 하 였 다 ( 도 10 a ) . evoCas 9 에 의한 고 빈도 절단 ( 온 - 타 겟 보다 더 많 음 ) 을 제시 하 는 단지 1 개 의 오프 - 타 겟 이 분석 으로부터 나타났으며 , 이 는 아마도 의도 된 타 겟 으로부터 단지 2 개 의 뉴클레오티드 만큼 상이 하 고 , 각각 의 미시 매치 의 수준 에서 시토신 의 2 개 의 비 중단 된 스트레치 를 함유 한 이러 한 서열 의 특정 한 성질 에 기인 하 였으며 ( 도 10 a ) , 이 는 가능 하 게 는 비 - 매칭 뉴클레오티드 를 수용 하 는 벌지 부위 의 형성 을 허용 한다 .