메 발론 산 생합성 경로 내 의 제 2 유전자 , PMK 를 하 기 프라이머 를 사용 하 여 증폭 하 였 다 : PstI - PMK 1 R ( 5 '- GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC , SEQ ID NO : 23 ) 및 BsiHKA I - PMK 1 F ( 5 '- C G A C T G G T G C A C C CTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG , SEQ ID NO : 24 ) . 제 조사 의 지시 사항 에 따라 Pfu Turbo 중합효소 ( Stratagene ) 를 사용 하 여 PCR 반응 을 수행 하 였 다 . 올바른 크기 의 생성물 ( 1387 bp ) 을 PstI 및 BsiHKI 로 소화 시키 고 , PstI 로 소화 된 pTrcMVK 1 에 라 이게 이 션 하 였 다 . 생성 된 플라스미드 를 pTrcKK 로 지칭 하 였 다 . MVD 및 idi 유전자 를 동일 한 방식 으로 클로닝 하 였 다 . 프라이머 쌍 PstI - MVD 1 R ( 5 '- GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC , SEQ ID NO : 25 ) 및 NsiI - MVD 1 F ( 5 '- G T A G A T G CATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG , SEQ ID NO : 26 ) 를 사용 하 여 PCR 을 실행 하 여 MVD 유전자 및 PstI - YIDI 1 R ( 5 '- C CTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC , SEQ ID NO : 27 ) 및 NsiI - YIDI 1 F ( 5 '- C A T C A A T G C A T C G CCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC , SEQ ID NO : 28 ) 를 증폭 하 여 yIDI 유전자 를 증폭 하 였 다 . 일부 경우 에서 IPP 이성화 효소 유전자 , 대장균 으로부터 의 idi 를 사용 하 였 다 . 대장균 으로부터 의 idi 를 증폭 하 기 위해 , 하 기 의 프라이머 세트 를 사용 하 였 다 : PstI - CIDI 1 R ( 5 '- GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG , SEQ ID NO : 29 ) 및 NsiI - CIDI 1 F ( 5 '- C A T C A A T G C A T CGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG , SEQ ID NO : 30 ) . 주형 DNA 는 대장균 FM 5 로부터 표준 방법 에 의해 단리 된 염색체 DNA 였 다 ( WO 96 / 35796 및 WO 2004 / 033646 ; 특히 핵산 의 단리 에 대해 그 전문 이 참 고 문헌 으로 각각 포함 됨 ) . 최종 플라스미드 를 , 호모 idi 유전자 를 인코딩 하 는 구성 물 에 대해서 는 pKKDIy 로 , 또는 대장균 idi 유전자 를 인코딩 하 는 구성 물 에 대해서 는 pKKDIc 로 지칭 하 였 다 . 플라스미드 를 후속 적 분석 을 위해 대장균 숙주 BL 21 에 형질 전환 하 였 다 . 일부 경우 에서 쿠 주 로부터 의 이소프렌 신 타아 제 를 pKKDIy 에 클로닝 하 여 플라스미드 pKKDIyIS 를 수득 하 였 다 .