화학식 1 의 화합물 에 대한 이식 면역 거부 반응 을 매개 하 는 T 세포 에 의해 생성 되 는 인터페론 - 감마 ( interferon - gamma ) 억제 효과 를 확인 하 기 위하 여 효소 결합 면역 흡수 분석법 ( Enzyme - Linked Immunosorbent Assay , ELISA ) 으로 분석 하 였 다 . 상기 실험 예 1 에서 배양 된 세포 의 배양액 을 회수 하 여 냉동 보관 하 였 다 . 0 . 1 ml 의 항 - 인터페론 - 감마 항체 를 효소 결합 면역 흡수 분석법 플레이트 ( plate ) 의 각 웰 에 주입 하 고 실온 에서 12 시간 동안 부착 시켰 다 . 세 척 용액 ( 0 . 2 % Tween X - 100 / PBS ) 으로 5 차례 세척 한 후 분석 완충 용액 ( assay buffer , 2 % BSA / PBS ) 을 0 . 1 ml 씩 넣 고 실온 에서 1 시간 동안 반응 시켰 다 . 분석 완충 용액 을 제거 한 후 , 냉동 보관 중 인 각 배양액 을 0 . 1 ml 씩 각 웰 에 넣 고 실온 에서 2 시간 동안 반응 시켰 다 . 2 시간 후 , 플레이트 의 각 웰 을 세척 용액 으로 5 차례 세척 하 고 바이오틴 ( biotin ) - 부착 검출 항체 ( conjugated detection mAb ) 를 0 . 1 ml 씩 각 웰 에 넣 고 실온 에서 2 시간 동안 반응 시켰 다 . 반응 후 각 웰 을 5 차례 세척 하 고 0 . 1 ml 의 호스 래 디쉬 - 부착 스 트 렙 트 아 비딘 ( horseradish peroxidase ( HRP ) - conjugated streptavidin ) 을 넣 고 실온 에서 30 분 간 반응 시켰 다 . 반응 후 각 웰 을 5 차례 세척 하 고 0 . 1 ml 의 테트라메틸 벤지딘 ( tetramethyl benzidine ) 기질 을 넣 고 발색 시켰 다 . 발색 은 50 ㎕ 의 정지 용액 ( stop solution ) 을 넣 어 중단 시킨 후 450 nm 에서 효소 결합 면역 흡수 분석법 플레이트 분석기 ( plate reader , Molecular Devices , USA ) 로 흡광도 ( optical density ) 값 을 구한 후 표준 곡선 ( standard curve ) 값 에 적용 시켜 정량 화 하 였 다 .