항체 를 정상 인간 혈청 ( NHS ) 에서 인 큐 베이 션 한 후 전형 적 보체 경로 활성 화 에 대한 마커 인 C 4 d 의 정량화 에 의해 항체 변이체 에 의한 표적 결합 - 비 의존 성 보체 활성 화 를 결정 하 였 다 . ( 1 ) 인간 C 4 의 C 4 d - 함유 활성 화 단편 에 특이 적 으로 결합 하 는 마우스 모노클 로 날 항체 로 코팅 된 마이크 로 어 세이 플레이트 , ( 2 ) HRP - 접합 된 염소 항 - 인간 C 4 d 항체 , 및 ( 3 ) 발색 기질 을 함유 하 는 마이크 로 뷰 ( MicroVue ) C 4 d 효소 면역 검정 ( 퀴델 , 카탈로그 번호 A 0008 ) 을 사용 하 여 3 - 단계 ELISA 절차 를 수행 하 였 다 . 내부 대 조군 및 표준물 을 키트 에 보충 하 고 , 제조 업체 설명서 에 기재 된 바 와 같이 사용 하 였 다 . 양성 대 조군 으로서 , 열 응집 된 감마 글로불린 을 하 기 와 같이 제조 하 였 다 . IVIG 용액 의 1 . 5 ml 바이알 내 1 mL 분취 물 ( 60 mg / mL ; 산 퀸 , 카탈로그 번호 04 H 04 H 443 A ) 을 63 ℃ 에서 20 분 동안 가열 하 였 다 . 바이알 을 풀 링 하 고 , PBS 에 의해 20 mg / mL 로 희석 하 고 , 0 . 22 μ m 세공 무계 면 활성제 셀룰로스 아세테이트 ( SFCA ) 막 시린지 필터 ( 코닝 ( Corning ) , 카탈로그 번호 431219 ) 를 통해 여과 하 였 다 . ~ 0 . 2 mL 의 분취 물 을 4 ℃ 에서 저장 하 였 다 . 항체 샘플 의 경우 , 90 % 정상 인간 혈청 ( NHS , 산 퀸 M 0008 AC ) 중 100 μ g / mL 항체 제제 의 50 μ L 샘플 을 폴리프로필렌 96 - 웰 U - 바닥 플레이트 ( 그 라이너 바이오 - 원 ; 카탈로그 번호 650261 ) 에서 1 시간 동안 37 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 5 μ L 의 이 들 샘플 을 시편 희석제 에 의해 90 x 희석 하 고 , 웰 당 100 μ L 의 희석 된 샘플 을 250 μ L 세척 용액 으로 3 회 사전 세척 한 코팅 된 스트립 에서 진탕 시키 면서 실온 에서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 웰 을 250 μ L 세척 용액 으로 5 회 세척 한 후 , 웰 당 50 μ L C 4 d 접합체 를 진탕 시키 면서 실온 에서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 웰 을 250 μ L 세척 용액 으로 5 회 세척 한 후 , 웰 당 100 μ L 기질 을 진탕 시키 면서 실온 에서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 웰 당 50 μ L 정지 용액 을 첨가 하 여 반응 을 정지 시키 고 , 바이 오텍 EL 808 마이크 로 플레이트 판독기 ( 바이오 SPX ) 에서 405 nm 에서 분광 광도계 로 색 강도 를 측정 하 였 다 .