Cas 9 와 가이드 RNA 리보 핵단백질 ( RNP ) 복합체 의 조립 , HSPC 의 제조 , 및 HSPC 내로 의 RNP 의 전기 천 공 . 전기 천 공 직전 에 , Cas 9 - 가이드 RNA 리보 핵단백질 복합체 ( RNP ) 를 제조 하 였 다 . 이중 가이드 RNA ( dgRNA ) 를 사용 한 RNP 의 형성 을 위해 , 6 μ g 의 각각 의 crRNA ( 4 . 5 μ L 중 ) 및 tracr ( 2 . 52 μ L 중 ) 를 우선 , 개별 튜브 에서 95 ℃ 에서 2 분 동안 변성 시키 고 , 그 후 에 , 실온 까지 냉각 시켰 다 . Cas 9 단백질 의 제조 를 위해 , 12 μ g 의 CAS 9 단백질 ( 2 μ L 중 ) 을 1 μ L 의 10 x CCE 완충제 ( 20 mM HEPES , 100 mM KCL , 5 mM MgCL 2 , 5 % 글리세롤 및 신선 하 게 첨가 된 1 mM DTT ) 와 혼합 하 였 다 . Tracr 를 우선 , Cas 9 조 제물 과 혼합 하 고 , 37 ℃ 에서 5 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 그 후 에 , crRNA 를 Tracr / CAS 9 복합체 에 첨가 하 고 , 37 ℃ 에서 5 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 없 음 / 대 조군 조건 의 경우 , crRNA 이외 의 비 히 클 을 tracr / CAS 9 복합체 에 첨가 하 였 다 . HSPC 를 원심 분리 에 의해 수합 하 고 , 2 . 8 x 106 / mL 의 세포 밀도 에서 Lonza 전기 천 공 키트 ( Cat # V 4 XP - 3032 Lonza Amaxa P 3 1 차 세포 4 - D 핵 감염 X Kit S ) 에 포함 된 P 3 완충제 + 보충 제 에 재현 탁 시켰 다 . RNP 를 40 μ L 의 세포 와 함께 위아래 로 파이 펫 팅 함 으로써 혼합 하 고 , RT 에서 2 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 각각 의 복제물 에 대해 , 21 μ L 의 the RNP / 세포 혼합물 을 Lonza Amaxa P 3 1 차 세포 4 - D 핵 감염 X 키트 S 내 로 옮겼 다 . 전기 천공 을 Lonza 형질 감염 시스템 ( 4 D - Nucleofector X Unit ) 을 이용 하 여 프로토콜 CM - 137 을 사용 하 여 수행 하 였 다 . 2 벌 중복 21 μ L 전기 천공 을 수행 하 였 다 .