제 7 차 녹차 심포 지움 녹차 추출물 의 산화 적 , 염증 적 조직 손상 에 미치 는 보호 효과 Chemopreventive and Chemoprotective Effects of Green Tea Polyphenol on Oxidative and Inflammatory Tissue Damage 서영준 , 나 혜 경 , 이정상 , Joydeb k . Kundu , 천경수 서울대 학교 약학 대학 생화 학실 There are multiple lines of compelling evidence from epidemiologic and laboratory studies supporting that frequent consumption of green tea is inversely associated with the risk of several types of human cancer and other chronic diseases . The chemopreventive and chemoprotective effects of green tea have been attributed to its polyphenols . In the present study , we have examined the effects of green tea polyphenolic fraction ( supplied from Pacific Co . ) on ethanol - induced gastric damage in rats . Intragastric administration of absolute ethanol to male Sprague - Dawley rats caused inflammatory tissue damage which was accompanied by elevated ｅxpression of cyclooxygenase - 2 ( COX - 2 ) and inducible nitric oxide synthase ( iNOS ) as well as transient activation of the eukaryotic transcription factors NF - κ B and AP - 1 . Oral administration of the green tea extract ameliorated ethanol - induced ｅxpression of COX - 2 and iNOS , and also activation of extracellular signal - regulated kinase ( ERK ) and p 38 mitogen - activated protein kinase , which are upstream signaling enzymes involved in regulating the ｅxpression of the above proinflammatory enzymes . one of the most well - defined mechanisms underlying chemopreventive effects of green tea or its polyphenols is suppression of tumor promotion . Administration of the green tea extract ( 20 or 50 mg / kg body wt . ) by gavage blocked the phorbol ester - induced COX - 2 ｅxpression in mouse skin . Likewise , epigallocatechin gallate , a major antioxidative polyphenol present in green tea , inhibited the COX - 2 induction concentration dependently in cultured human mammary epithelial cells stimulated with phorbol ester . The effects of the green tea extract on Helicobacter pylori - induced gastric inflammation in Mongolian gerbil as well as those of EGCG on phorbol ester - induced inflammatory signal transduction in mouse skin are under investigation in this laboratory . 서 론 암 ( cancer ) 은 다 단계 ( multi - stage ) 로 진행 되 며 , 크 게 개시 단계 ( initiation ) , 촉진 단계 ( promotion ) 그리고 진행 단계 ( progression ) 세 과정 으로 구분 된다 . 이러 한 일련 의 다단계 발암 과정 ( multi - stage carcinogenesis ) 중 적어도 어느 한 과정 을 억제 하 거나 또는 그 진행 을 지연 시킴 으로서 암 예방 을 기대 할 수 있 으며 , 최근 에 독성 이 없 는 화합물 , 식이 성분 또는 약물 을 이용 하 여 그 진행 을 억제 시키 거나 지연 시키 려는 개념 의 화학 적 암 예방 ( chemoprevention ) 에 많 은 관심 이 집중 되 고 있 다 . 화학 적 암 예방 이 란 독성 이 없 는 안전 한 화학 물질 을 이용 하 여 발암 과정 을 인위 적 으로 억제 하 거나 지연 또는 역전 시킴 으로써 정상 세포 가 암세포 로 전이 되 는 것 을 예방 하 려는 암 연구 의 새로운 전략 으로 기존 의 항암제 에 의한 치료 ( chemotherapy ) 와 는 다른 개념 이 다 ( 1 ) . 일련 의 다단계 발암 과정 중 전암 단계 인 개시 ( initiation ) 단계 는 비가역 적 으로 진행 되 는 과정 이 므로 이미 환경 발암 물질 에 노출 되 어 DNA 의 부분 적 손상 이 초래 된 세포 를 갖 고 있 는 대부분 의 성인 의 경우 에 는 개시 단계 를 억제 하 는 암 예방 은 그리 실효 성 이 없 다 . 그러나 , 발암 과정 의 후기 단계 인 촉진 단계 ( promotion ) 의 경우 에 는 20 - 30 년 동안 서서히 진행 되 는 가역 적 과정 이 므로 이미 개시 된 경우 라도 촉진 단계 를 억제 , 지연 또는 역전 시키 면 최종 적 으로 암 을 예방 할 수 있 다 . 따라서 암 예방 제 의 목적 으로 사용 할 대상 화합물 을 찾 고자 하 는 경우 에 는 개시 단계 보다 는 촉진 단계 를 저해 하 는 anti - tumor promoter 를 개발 하 는 것 이 보다 현실 적 이 고 실용 성 이 있 는 것 으로 인식 되 고 있 다 . 암 촉진 단계 는 조직 의 염증 ( inflammation ) 이나 산화 적 손상 ( oxidative stress ) 에 의해 유도 될 수 있 는 것 으로 알려져 있 다 . 따라서 소염 작용 ( anti - inflammatory effect ) 이나 항산 화 작용 ( antioxidative activity ) 을 갖 는 물질 들 의 경우 발암 촉진 단계 의 억제제 로 작용 할 가능 성 이 높 다 . 최근 에 , 이런 발암 과정 을 예방 할 수 있 는 물질 을 천연물 특히 식품 에서 찾아내 려는 노력 이 계속 진행 되 고 있 다 ( 2 , 3 ) . 실제로 미국 국립 암 연구소 에서 유망 한 화학 암 예방 후보 물질 로 선별 되 어 전 임상 및 임상 시험 에 들어갔 거나 대기 중 인 화합물 들 중 에 는 상당수 가 식이 식물 에서 유래 한 phytochemincal 들 이 다 . 한 예 로서 울금 ( turmeric ) 의 주 항산 화 성분 으로 카레 ( curry ) 의 노란 색소 로 이용 되 고 있 는 curcumin 은 미국 국립 암 연구소 주관 으로 화학암 예방 후보 물질 로 개발 을 위한 임상 시험 에 들어간 대표 적 천연 화합물 이 다 . 녹차 는 오래 전 부터 민간 생약 으로 사용 되 어 온 식물 로 항산 화 작용 , 노화 억제 효과 , 중금속 제거 효과 , 항 당뇨 효과 등 으로 사용 되 었 다 ( 4 , 5 ) . 또한 녹차 는 항암 효과 , 지방간 의 예방 , 다이어트 효과 , 항 알레르기 효과 , 에이즈 바이러스 역전사 효소 에 대한 억제 효과 , 담배 의 해독 효과 , 구취 및 냄새 제거 효과 , 차 향기 성분 의 기능 성 , 알칼리 성 체질 개선 효과 , 염증 치료 효과 , 기억력 및 판단력 증진 , 피부 미용 효과 , 면역력 증강 , 스트레스 해소 , 변비 개선 효과 , 카페인 의 생리 작용 , 데 아닌 의 생리 작용 , 방사능 해독 작용 등 이 있 다 . 녹차 에 의한 항암 효과 가 여러 연구자 들 에 의해 보 고 되 었 으나 , 대부분 암세포 에 대한 증식 억제 및 세포 사멸 의 유도 효과 에 관한 내용 이 고 정상 세포 의 암세포 로 의 진행 과정 을 억제 하 는 , 즉 화학 적 암 예방 작용 에 대해서 는 상대 적 으로 제한 된 연구 결과 가 소개 되 고 있 다 . 알코올 섭취 가 맥주 , 포도주 , 또는 증류주 등 의 종류 에 상관없이 몇 가지 암 및 관상동맥 질환 의 발생 율 을 증가 시킨다는 연구 , 그리고 간 에서 알코올 이 대사 되 는 과정 을 거치 면서 이것 이 간 기능 이 퇴화 나 경화 가 되 는 주 된 원인 이 되 어 간암 을 유발 시킨다는 임상 적 증거 가 축적 되 어 왔 다 ( 6 - 8 ) . 한국인 의 알코올 섭취 와 자극 적 인 음식 을 선호 하 는 문화 가 높 은 위암 발생 률 과 연관 있 을 것 이 라는 많 은 보고 에 도 불구 하 고 그 분자 생물학 적 기전 연구 를 바탕 으로 이러 한 연관 성 을 검증 해 보 려는 시도 는 많 지 않 았 다 . 알코올 은 적 은 용량 에서 는 건강 에 이로운 점 도 있 지만 , 그 자체 로서 도 발암 성 이 있 고 종양 발생 을 촉진 할 뿐 만 아니 라 알코올 이 다른 발암 성 물질 이 쉽 게 신체 조직 에서 용해 될 수 있 도록 옮겨 주 는 효과 적 인 용해제 로서 작용 할 수 도 있 다고 한다 . 또한 알코올 을 절인 생선 및 채소 , 짠 음식 , 전분 이 많이 든 음식 , 조리 한 시리얼 , 베이컨 , 상한 음식 , 탄 음식 , 그리고 식품 첨가물 중 질소 산화물 이 많이 첨가 된 음식 ( 훈제 식품 등 ) 과 함께 섭취 시 위암 발병 율 을 높인다고 한다 . 이러 한 보고 들 을 토대 로 알코올 이 위암 발생 의 촉진제 ( promoter ) 가 될 수 있 다는 것 을 예상 할 수 있 지만 아직 직접 적 으로 알코올 이 어떻 게 암 의 발생 및 진행 과정 에 영향 을 미치 는 지 에 대해서 는 거의 연구 가 이루어지 지 않 고 있 다 . 다 단계 발암 과정 중 종양 촉진 단계 는 통상 염증 ( inflammation ) 을 수반 하 며 , interleukin - 1 ( IL - 1 ) , tumor necrosis factor - α ( TNF - α ) 과 같 은 proinflammatory cytokine 의 생 성 및 프로 스타 그란딘 생합 성 에 관여 하 는 cyclooxygenase - 2 ( COX - 2 ) 의 발현 이 증가 하 는 것 으로 보 고 되 고 있 다 ( 9 - 11 ) . COX - 2 가 발암 과정 에 연루 되 어 있 다는 것 은 여러 실험 적 / 임상 적 증거 를 통해 뒷받침 된다 . 대장암 , 폐암 , 위암 , 간암 등 각종 암 조직 에서 COX - 2 의 발현 이 주변 의 정상 조직 에 비해 월등히 높 은 것 이 관찰 되 고 있 고 , 전 이능 과 관련 된 표현 형 변화 를 일으킨다 ( 12 - 15 ) . 반면 COX - 2 의 선택 적 저해 는 세포 증식 을 억제 하 고 특정 암세포 의 사멸 을 유도 하 기 도 한다 ( 16 , 17 ) . COX - 2 와 종양 형성 이 직접 연관 되 어 있 다는 다른 증거 로 ‘ 가족 성 용종 증 ( familial adenomatous polyposis ) ' 의 동물 모델 인 “ Apc knockout mouse 에 COX - 2 유전자 를 돌연변이 시키 거나 COX - 2 의 선택 적 저해제 를 처리 한 경우 소장 의 용종 ( polyps ) 수 와 크기 가 상당히 감소 한 것 을 들 수 있 다 ( 18 , 19 ) 이상 의 연구 결과 들 을 종합 해 볼 때 , 암 의 병태 생리 에 COX - 2 가 관련 되 어 있 음 을 알 수 있 고 , 따라서 이 효소 의 부적절 한 과다 발현 유도 을 억제 하 는 것 은 화학 적 암 예방 에 있 어 상당히 효과 적 이 고 실리 적 인 방법 이 라 여겨진다 . 녹차 의 폴리 페놀 분획 및 그 구성 성분 들 은 항 종양 촉진 작용 을 나타냄 이 보 고 되 고 있 다 . 본 연구 에서 는 종양 촉진제 인 phorbol ester 와 알코올 에 의한 조직 염증 과정 에서 그 생합성 이 유도 되 는 cyclooxygenase - 2 ( COX - 2 ) 의 발현 이 녹차 추출물 및 그 주 항산 화 성분 인 epigallocatechin gallate ( EGCG ) 처리 시 감소 하 는 지 를 살핌 으로써 녹차 의 종양 촉진 억제 효과 를 평가 하 고 그 분자 생물학 적 기전 을 통해 규명 하 고자 하 였 다 . 아울러 종양 촉진 과 밀접 한 관련 이 있 는 NF - κ B 및 AP - 1 두 전사인자 들 의 활성 화 및 이 를 조절 하 는 상위 신호 전달 계 효소 인 mitogen - activated protein kinase ( MAPK ) 에 대한 억제 여부 를 살펴보 았 다 . 실험 방법 1 . In vivo 실험 1 . 1 알코올 투여 에 의한 랫 드 의 위 점막 손상 유도 1 ) Sprauge - Dawley ( SD ) 랫 드 의 위장 점막 에서 알콜 에 의한 COX - 1 과 COX - 2 단백질 의 발현 유도 건강 한 수컷 의 Sprauge - Dawley ( SD ) rat 를 약물 투여 12 ～ 16 시간 전 부터 절식 시킨 다음 에 에탄올 1 . 0 ml 을 경구 투여 하 였 다 . 에탄올 투여 후 시간 에 따라 sacrifice 하 여 위 를 적출 한 다음 , 점막층 ( mucosa layer ) 만 을 따로 분리 하 여 시간 에 따른 COX - 1 과 COX - 2 의 발현 변화 및 MAPKs 활성 변화 를 Western blot analysis 를 통해 관찰 하 였 다 . 2 ) 알코올 로 유도 된 COX - 1 , COX - 2 , β - catenin 및 iNOS 발현 및 MAPK 활성 화 에 대한 녹차 추출물 의 영향 건강 한 수컷 의 SD rat 에게 약물 투여 하 기 12 ～ 16 시간 전 부터 절식 시켰 다 . 에탄올 1 . 0 ml 을 투여 하 기 30 분 전 에 EGCG 를 60 % 이상 함유 하 는 녹차 추출물 ( GTE ) 을 용량 에 따라 경구 투여 하 여 1 시간 째 sacrifice 하 여 위 를 적출 한 다음 , 점막 을 따로 분리 하 여 알콜 에 의해 유도 된 COX - 1 , COX - 2 , β - catenin , iNOS 의 발현 및 MAPK 의 활성 화 를 Western blot analysis 를 통해 관찰 하 였 다 . 3 ) 알코올 에 의한 NF - κ B 와 AP - 1 의 활성 화 및 관련 단백질 의 변화 검토 에탄올 1 ml 를 SD 랫 드 에 경구 투여 한 후 전사 인 자 인 NF - κ B 와 AP - 1 의 활성 화 를 electrophoretic mobility shift assay ( EMSA ) 를 이용 하 여 확인 하 였 다 . 동시 에 nuclear 분 핵 과 cytoplasmic 분 핵 으로 나누 어 각각 분리 한 다음 에탄올 처리 에 의한 I κ B 의 분해 를 관찰 하 고 , p 65 의 세포질 에서 핵 으로 의 translocation 을 살펴보 았 다 . 1 . 2 . 마우스 의 피부 염증 유도 ICR 마우스 등 의 털 을 동물 용 clipper 를 이용 하 여 깎 은 후 탈모제 를 발라 완전히 제거 하 였 다 . 녹차 추출물 을 농도 에 따라 0 . 5 % carboxymethyl cellulose 에 녹여 경구 투여 하 였으며 , 1 시간 후 acetone 에 녹인 TPA 를 마우스 등 에 국소 도포 하 여 4 시간 후 ICR 마우스 를 희생 시켜 피부 를 잘라 내 고 얼음 위 에서 connective tissue , fats 를 제거 한 후 유발 에 옮기 고 액체 질소 와 함께 유봉 으로 분쇄 시켰 다 . 거의 분말 상태 가 된 피부 를 ice cold RIPA buffer ( 25 mM Tris - HCl ( pH 7 . 2 ) , 0 . 1 % sodium dodecyl sulfate , 1 % Triton X - 100 , 1 % sodium deoxycholate , 0 . 15 M NaCl , 1 mM EDTA ) 를 사용 하 여 균질 화 시키 고 30 μ g 의 단백질 을 SDS - polyacrylamide gel 에 전기영동 시킨 후 nitrocellulose paper 에 electroblotting 한다 . COX - 2 , p 38 MAP Kinase , ERK 1 / 2 protein 에 대한 antibody ( Santa Cruz , CA , USA ) 를 사용 하 여 Western blot analysis 를 수행 하 였 다 . 2 . In vitro 실험 1 ) 세포 배양 MCF 10 A 세포 는 DMEM / F 12 , 10 μ g / ml insulin ( bovine ) , 100 ng / ml Cholera toxin , 0 . 5 μ g / ml hydrocortion , 20 ng / ml recombinant human epidermal growth factor ( rhEGF ) , 0 . 5 μ g / ml fungi zone , 200 mM L - glutamin , 100 μ g / ml penicillin / streptomycin mixture , 5 % horse serum 이 함유 된 배지 상 에서 37 ℃, 5 % CO 2 항온기 에서 배양 하 였 다 . 2 ) COX - 1 , COX - 2 발현 및 MAPKs 활성 측정 MCF 10 A 세포 ( 5 × 106 cells / ml ) 를 100 mm plate 에 2 ml 씩 깔 고 , TPA 10 nM 을 가하 여 시간 의존 적 으로 배양 하 였 다 . cell harvest 를 ice cold RIPAbuffer 를 사용 하 여 균질 화 시키 고 30 μ g 의 단 백 량 을 SDS - polyacrylamide gel 에 전기영동 시킨 후 PVDF paper 에 electroblotting 하 였 다 . COX - 1 , COX - 2 , MAPK 에 대한 변화 를 각각 의 항체 를 사용 하 여 Western blot analysis 를 수행 하 였 다 . 3 ) TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 발현 및 MAPKs 활성 화 에 대한 EGCG 의 영향 MCF 10 A 세포 ( 5 × 106 cells / ml ) 를 100 mm plate 에 2 ml 씩 깔 고 , TPA 10 nM 과 EGCG 를 동시 에 처리 한 후 단백질 을 분리 하 여 TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 , MAPK 에 대한 EGCG 에 대한 영향 을 각각 의 항체 를 사용 하 여 Western blot analysis 방법 으로 확인 하 였 다 . 4 ) 전사인자 NF - κ B 활성 화 측정 MCF 10 A 세포 ( 5 × 106 cells / ml ) 에 TPA ( 10 nM ) 를 시간 의존 적 으로 처리 한 다음 세포 를 수확 하 여 1 ml buffer A 에 ( 10 mM HEPES , pH 7 . 8 , 10 mM KCl , 2 mM MgCl 2 , 1 mM DTT , 0 . 1 mM EDTA , 0 . 1 mM PMSF ) 넣 고 4 ℃ 에서 20 초간 homogenization 하 여 20 분 간 방치 하 였 다 . 120 μ l 10 % Nonidet P - 40 을 넣 고 약하 게 vortex 한 후 에 12 , 000 rpm , 30 초간 원심 분리 했 다 . 얻 어 진 pelleted nuclei 를 400 ㎕ buffer A 와 25 ㎕ 의 10 % Nonidet P - 40 과 섞 어 12 , 000 rpm . 에서 30 초간 원심 분리 했 다 . 얻 어 진 pellet 을 50 ㎕ 의 Buffer C ( 50 mM HEPES , pH 7 . 8 , 50 mM KCl , 300 mM NaCl , 1 mM DTT , 0 . 1 mM EDTA , 0 . 1 mM PMSF , 10 %( v / v ) glycerol ) 에 suspension 한 후 20 분 간 방치 했 다 . 12 , 000 rpm 에서 5 분 간 원심 분리 후 상등 액 을 - 70 ℃ 에 보존 했 다 . 위 에서 얻 은 nuclear extract ( 10 μ g ) 에 5 × buffer ( Promega ) 5 ㎕ 와 H 2 O 를 넣 어 총 25 ㎕ 를 만들 고 이 를 4 ℃ 에서 15 분 간 방치 하 였 다 . 여기 에 32 P - end labeled - double strand - oligonucleotides ( Promega ) 를 Nick spin column ( Pharmacia biotech ) 을 이용 하 여 정제 한 후 100 , 000 cpm 상당 의 oligonucleotides 를 섞 어 20 분 간 상온 에서 반응 시켰 다 . 각각 의 반응 sample 을 2 ㎕ bromophenol blue 와 혼합 하 여 6 % polyacrylamide 상 에서 free - oligonucleotides 와 DNA - protein complex 를 분리 하 고 gel 을 건조 시켰 다 . Fuji film model BAS - 2500 photo imager 를 이용 하 여 시각 화 하 고 정량 하 였 다 . 5 ) TPA 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 의 활성 에 대한 EGCG 의 영향 MCF 10 A 세포 ( 5 × 106 cells / ml ) 에 TPA ( 10 nM ) 와 다양 한 농도 의 EGCG 를 동시 에 2 시간 처리 한 다음 세포 를 수확 하 여 EMSA 를 수행 하 였 다 . 결 과 1 . 에탄올 투여 에 의한 랫 드 의 위 점막 염증 관련 효소 발현 유도 염증 반응 을 매개 하 는 COX - 2 의 발현 이 에탄올 처리 15 분 부터 6 시간 까지 계속 적 으로 증가 하 였 다 ( Fig . 1 ) . COX - 2 의 동종 효소 ( isozyme ) 으로서 위장관 보호 나 신장 의 혈류 조절 등 생체 의 항상성 유지 에 관여 한다고 알려진 COX - 1 의 발현 또한 비슷 한 시간 대 에 일시 적 으로 증가 함 을 확인 하 였 다 ( Fig . 1 ) . Fig . 1 Kinetics of cyclooxygenases induced by ethanol in rat gastric mucosa . 2 . 에탄올 투여 에 의해 유도 된 염증 관련 단백질 발현 에 대한 녹차 추출물 의 억제 효과 에탄올 투여 에 의해 유도 된 COX - 1 , COX - 2 및 iNOS 의 발현 에 대한 녹차 추출물 의 영향 을 알아보 기 위해 알코올 투여 30 분 전 에 녹차 추출물 을 1 시간 동안 전처리 하 여 각각 의 단백질 의 발현 변화 를 Western blotting 으로 확인 한 결과 GTE 처리 군 에서 용량 의존 적 으로 COX - 2 의 발현 을 현저 하 게 감소 하 였으며 , COX - 1 의 발현 도 어느 정도 억제 하 였 다 ( Fig . 2 ) . 아울러 에탄올 처리 시 COX - 2 와 마찬가지 로 염증 반응 을 매개 하 는 데 중요 한 역할 을 하 는 것 으로 알려진 iNOS 의 발현 이 증가 되 었 으며 , 녹차 추출물 은 용량 의존 적 으로 에탄올 에 의해 증가 된 iNOS 의 발현 을 저해 하 였 다 ( Fig . 2 ) . Fig . 2 Effects of green tea extracts on the ｅxpression of COXs and iNOS in ethanol - treated rat gastric mucosa . 3 . 에탄올 투여 에 의한 랫 드 위 점막 의 NF - κ B 및 AP - 1 전사인자 활성 화 염증 관련 단백질 들 의 전사 조절 인자 로 알려진 NF - κ B 와 AP - 1 의 DNA - binding activity 를 EMSA 로 검증 해 본 결과 , 에탄올 에 의해 1 시간 째 NF - κ B 및 AP - 1 의 활성 이 최대 가 됨 을 알 수 있 었 다 ( Fig . 3 A , B ) . 또한 에탄올 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 와 AP - 1 이 과량 의 unlabled ( cold ) probe 존재 시 소멸 됨 을 통해 그 특이 성 ( specificity ) 를 확인 하 였 다 . 세포질 ( cytoplasm ) 내 에서 NF - κ B 의 p 65 / p 50 heterodimer 는 저해 단백질 인 I κ B α 에 의해 불활성 화 되 어 있 다가 , 외부 인자 들 에 의해 I κ B α 가 인산화 되 어 ubiquitination 되 고 degradation 되 면서 핵 내 로 이행 된다 . nuclear fraction 과 cytosol fraction 을 분리 하 여 관련 단백질 의 발현 변화 를 Western blotting 을 통해 확인 한 결과 세포질 내 의 I κ B α 와 nuclear fraction 의 p 65 level 은 에탄올 처리 후 상당히 빠른 게 일시 적 으로 인산화 되 었 다 ( Fig . 4 A , B ) . 에탄올 투여 후 1 시간 에 최대 의 활성 을 보였 던 NF - κ B 의 EMSA 결과 와 일치 하 며 COX - 1 , COX - 2 , iNOS 의 발현 을 조절 하 는 염증 관련 전자 조절 인자 의 작용기 전 으로 설명 할 수 있 다 . A ) B ) Fig . 3 Ethanol induced NF - κ B and AP - 1 activation in gastric mucosa of SD rats . A ) B ) Fig . 4 Kinetics of phosphorylation of I κ B α and p 65 in gastric mucosa of rats treated with ethanol . CE : cytosolic extract , WE : whole extracts 4 . 세포내 신호 전달 효소 및 단백질 발현 및 활성 화 에 미치 는 에탄올 의 영향 1 ) ERK and p 38 MAPK activation SD 랫 드 에 에탄올 을 경구 투여 한 후 NF - κ B 와 AP - 1 의 활성 을 조절 하 는 상위 신호 전달 분자 인 MAPKs 에 대한 영향 을 살펴보 았 다 . 시간 에 따라 에탄올 은 p 38 MAPK 활성 화 을 유도 하 였으며 ( Fig . 5 A ) , 에탄올 에 의한 p 38 MAPK 의 활성 화 가 녹차 추출물 에 의해 용량 의존 적 으로 현저히 억제 되 었 다 ( Fig . 5 B ) . ERK 1 / 2 의 활성 또한 녹차 추출물 에 의해 억제 됨 을 확인 하 였 다 ( Fig . 5 C ) . A ) B ) C ) Fig . 5 Kinetics of p 38 activation induced by ethanol ( A ) and effects of green tea extracts on ethanol - induced ERK 1 / 2 activation in rat gastric mucosa ( B ) . 2 ) β - catenin pathway 최근 보고 된 바 에 의하 면 β - catenin 의 이상 적 인 증가 가 gastric cancer 를 비롯 한 다양 한 암 의 발생 과 관련 되 어 있 으며 ( 20 ) , Wnt signal , growth factor signal 에 의해 cytoplasm 에 β - catenin 이 stabilization 이 되 고 , 핵 내 로 이동 되 며 핵 내 에서 증가 된 β - catenin 이 cox - 2 유전자 의 promoter region 에 존재 한 catenin / TCF binding element ( TBE ) 에 결합 하 여 COX - 2 mRNA 나 COX - 2 단백질 level 을 증가 시킨다고 보 고 되 고 있 다 ( 21 ) . gastric mucosa 에서 에탄올 에 의한 COX - 2 발현 유도 시 β - catenin 이 발현 이 관여 되 는지 의 여부 를 검토 하 였 다 . 에탄올 에 의해 β - catenin 의 발현 이 증가 되 었 으며 이 는 녹차 추출물 에 의해 용량 의존 적 으로 감소 함 을 확인 하 였 다 ( Fig . 6 ) . Fig . 6 Effects of green tea extracts on ethanol - induced β - catenin ｅxpression in rat gastric mucosa . 5 . ICR 마우스 의 dorsal skin 에서 TPA 에 의한 COX - 2 발현 및 녹차 추출물 의 영향 마우스 피부 에 대표 적 발암 촉진제 인 TPA 를 처리 시 염증 관련 효소 인 COX - 2 의 발현 이 유도 되 는 것 을 단백질 및 mRNA level 에서 확인 하 였 다 . 즉 자성 ICR mouse 의 탈모 시킨 dorsal skin 에 TPA 를 국소 도포 ( topical application ) 시 COX - 2 의 protein 이 4 시간 에서 최대 발현 되 었 고 ( Fig . 7 A ) , 그 mRNA 는 이 에 앞서 30 분 에서부터 발현 이 유도 되 었 다 ( Fig . 7 B ) . 녹차 추출물 을 마우스 에 경구 투 여시 TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 의 발현 이 감소 됨 을 확인 하 였 다 ( Fig . 7 C ) . A ) B ) C ) Fig . 7 Kinetics of COX - 2 ｅxpression induced by TPA and effects of green tea extract on TPA - induced COX - 2 ｅxpression in mouse skin . 6 . ICR 마우스 의 dorsal skin 에서 β - catenin 의 발현 에 대한 EGCG 의 영향 TPA 에 의한 COX - 2 의 발현 에 신호 전달 단백질 인 β - catenin 과 어떠 한 상관 관계 가 있 는지 를 알아보 고자 β - catenin 에 대해 Western blotting 을 실시 하 였 다 . TPA 에 의해 β - catenin 은 유도 되 지 않 았 으며 녹차 추출물 에 의한 억제 효과 도 없 었 다 . 그러나 녹차 성분 중 하나 인 EGCG 를 녹차 추출물 대신 경구 투 여시 basal β - catenin 의 발현 을 억제 함 을 확인 하 였 다 ( Fig . 8 ) . Fig . 8 Effects of EGCG on β - catenin ｅxpression in mouse skin . 7 . EGCG 가 배양 된 인체 유방 상피세포 에서 TPA 에 의한 COX - 2 의 발현 과 MAPK 및 NF - κ B 활성 화 에 미치 는 영향 1 ) MCF - 10 A cell 에서 TPA 에 의한 COX - 2 의 시간 에 따른 발현 시간 에 따라 TPA 에 의한 COX - 2 의 발현 을 알아본 결과 TPA 처리 4 시간 부터 COX - 2 의 발현 이 증가 되 어 8 시간 에 감소 하 였으며 , 용매 로 사용 한 DMSO 는 COX - 2 의 발현 을 유도 하 지 않 았 다 ( Fig . 9 ) . Fig . 9 Kinetics of COX - 2 ｅxpression induced by TPA in the MCF 10 A cells . 2 ) TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 의 발현 에 대한 EGCG 의 영향 EGCG 가 TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 의 발현 을 억제 하 는지 확인 하 고자 COX - 2 에 대해 Western blot analysis 를 수행 한 결과 농도 의존 적 으로 EGCG 가 TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 의 발현 을 억제 함 을 확인 하 였 다 ( Fig . 10 ) . Fig . 10 Effects of EGCG on TPA - induced COX - 2 ｅxpression in MCF 10 A cells . 3 ) MCF - 10 A cell 에서 TPA 에 의한 p 38 MAPK 와 ERK 의 시간 에 따른 활성 화 TPA 에 의한 p 38 MAPK 와 ERK 활성 을 시간 에 따라 조사 한 결과 TPA 처리 후 5 분 부터 ERK 가 phosphorylation 을 통해 활성 화 되 기 시작 하 여 점차 그 활성 이 감소 한 반면 에 p 38 MAPK 의 경우 , 아무것 도 처리 하 지 않 은 시료 와 TPA 를 처리 한 시료 간 에 아무런 변화 도 관찰 되 지 않 았 다 ( Fig . 11 ) . Fig . 11 Kinetics of ERK and p 38 MAPK activation induced by TPA in the MCF 10 A cells . 4 ) TPA 에 의해 활성 화 된 ERK 에 대한 EGCG 의 효과 TPA 에 의해 유도 된 ERK 의 활성 에 EGCG 가 미치 는 영향 을 ERK 의 활성 화 된 form 을 잡 는 antibody 를 사용 하 여 Western blot analysis 를 실시 해 본 결과 TPA 에 의해 활성 화 된 ERK 의 활성 을 억제 하 지 못하 였으나 total form 의 ERK 발현 은 오히려 감소 함 을 관찰 할 수 있 었 다 ( Fig . 12 ) . Fig . 12 Effects of EGCG on TPA - induced ERK 1 / 2 activation in MCF 10 A cells . 5 ) JNK 활성 에 대한 EGCG 의 영향 MCF - 10 A cell 에서 TPA 에 의해 p 38 MAPK 에 아무런 영향 을 주 지 않 아 또 다른 MAPK 중 하나 인 JNK 에 대한 EGCG 의 효과 를 Western blot analysis 를 이용 해 알아보 았 다 . TPA 에 의해 ERK 가 활성 화 되 는 5 분 에서 는 TPA 단독 처리 로 도 JNK 의 활성 을 유도 하 지 않 았 으며 EGCG 에 대한 어떠 한 효과 도 관찰 되 지 않 았 다 ( Fig . 13 ) . Fig . 13 Effects of EGCG on JNK activation in MCF 10 A cells . 6 ) TPA 에 의한 NF - κ B 의 시간 에 따른 활성 화 TPA 에 의해 다양 한 염증 관련 유전자 의 조절 전사 인 자 인 NF - κ B 가 활성 화 되 는지 를 EMSA 방법 을 사용 하 여 시간 에 따라 확인 한 결과 1 시간 째 에 TPA 에 의해 NF - κ B 의 DNA binding activity 가 최 대임 을 알 수 있 었 다 . 아울러 MCF - 10 A 세포 에서 TPA 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 가 어떠 한 subunit 으로 구성 되 어 있 는지 를 NF - κ B 의 주요 한 subunit 중 하나 인 p 65 와 p 50 의 각각 의 antibody 를 이용 하 여 shift assay 를 실시 한 결과 본 실험 에 사용 한 세포 에서 TPA 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 는 p 65 , p 50 heterodimer 로 구성 됨 을 알 수 있 었 다 ( Fig . 14 ) . Fig . 14 Kinetics of NF - κ B activation induced by TPA in MCF 10 A cells . 7 ) TPA 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 에 대한 EGCG 의 효과 TPA 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 에 대한 EGCG 의 효과 를 EMSA 방법 을 사용 하 여 알아본 결과 본 실험 에 사용 한 모든 농도 의 EGCG 가 TPA 에 의해 활성 화 된 NF - κ B 의 활성 에 영향 을 주 지 않 음 을 확인 하 였 다 ( Fig . 15 ) . 따라서 NF - κ B 외 의 다른 전사인자 들 ( 예 : AP - 1 , CREB , C / EBP ) 이 EGCG 에 의해 저해 됨 으로써 TPA 에 의해 유도 되 는 COX - 2 의 발현 억제 에 관여 할 것 으로 사료 된다 . Fig . 15 Effects of EGCG on TPA - induced NF - κ B activation in MCF 10 A cells . 결 론 녹차 추출물 은 알콜 로 유도 된 위장 의 염증 모델 및 TPA 에 의해 유도 된 피부암 모델 에서 각각 염증 반응 및 암화 과정 에 있 어 중요 한 역할 을 하 는 COX - 2 와 β - catenin 의 발현 을 현저 하 게 저해 하 였으며 또한 COX - 2 의 발현 을 조절 하 는 신호 전달 효소 중 하나 인 ERK 1 / 2 의 활성 을 저해 함 을 확인 할 수 있 었 다 . 녹차 성분 인 EGCG 는 인체 유방 상피세포 에서 TPA 에 의해 유도 된 COX - 2 의 발현 을 현저히 감소 하 였으나 COX - 2 의 발현 을 조절 하 는 중요 한 전사인자 중 의 하나 인 NF - κ B 의 활성 을 억제 하 지 는 않 았 다 . 따라서 EGCG 에 의한 COX - 2 발현 억제 는 NF - κ B 가 아닌 다른 전사인자 에 의해 조절 받 을 가능 성 이 높 으며 , 서로 다른 세 가지 의 모델 에서 녹차 추출물 과 EGCG 의 화학 적 암 예방 효과 의 분자 생물학 적 작용기 전 에 대한 구체 적 인 연구 가 현재 진행 중 이 다 . 참 고 문 헌 1 . 1 . Morse MA , Stoner GD . Cancer chemoprevention : principles and perspectives . Carcinongenesis 1993 ; 14 : 1737 - 1746 . 2 . Surh YJ . Cancer chemoprevention by dietary phytochemicals : a mechanistic viewpoint . Cancer J 1998 ; 11 : 6 - 10 . 3 . Surh YJ . Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances . 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