재조합 사람 IL - 21 ( SEQ ID NO : 2 ) , 사람 IL - 21 서열 유도 된 합성 펩티드 , 및 재조합 돌연변이 사람 IL - 21 ( SEQ ID NO : 7 ) 을 , 별도 로 96 웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트 의 표면 위 에 , 코팅 완충액 ( 0 . 1 M Na 2 CO 3 , pH 9 . 6 ) 중 의 1 ㎍/ mL 의 농도 로 100 μ L / 웰 의 부피 로 고정 시켰 다 . 플레이트 를 4 ℃ 에서 밤새 인 큐 베이 션 한 후 , 미 결합 단백질 을 흡인 하 고 , 플레이트 를 300 μ L / 웰 의 세 척 완충액 ( 0 . 137 M NaCl , 0 . 0022 M KCI , 0 . 0067 M Na 2 HPO 4 , 0 . 0020 M KH 2 PO 4 , 0 . 05 % v / w 폴리 소르 베이트 20 , pH 7 . 2 로서 규정 된 PBS - 트윈 ) 으로 2 회 세척 하 였 다 . 웰 을 200 μ L / 웰 의 차단 완충액 ( PBS - 트윈 + 1 % w / v 우 혈청 알부민 ( BSA ) ) 으로 1 시간 동안 차단 한 후 , 플레이트 를 세척 완충액 으로 2 회 세척 하 였 다 . 항체 희석 액 을 5 % 의 태아 우 혈청 ( FBS ) / 이스 코브스 변형 둘 베코 배지 ( IMDM ) 로 제조 하 여 1 ug / ml 로 조정 하 였 다 . 그런 다음 각 항체 희석 액 의 2 개 한 벌 샘플 을 분석 플레이트 에 100 μ L / 웰 로 옮겨서 항 - 사람 IL - 21 단백질 에 결합 시켰 다 . 주변 온도 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 한 후 에 웰 을 흡인 하 고 플레이트 를 상기 에서 설명 한 것 과 같이 2 회 세척 하 였 다 . 양 고추냉이 과산화 효소 ( HRP ) 표지 된 염소 항 마우스 IgG , Fc 특이 적 또는 염소 항 쥐 IgG , Fc 특이 적 , 또는 염소 항 사람 IgG , Fc 특이 적 ( Jackson ImmunoResearch Laboratories , West Grove , PA ) 을 5 % FBS / IM 으 배지 로 1 : 5000 으로 희석 하 여 각 웰 에 100 μ L / 웰 로 첨가 하 고 , 플레이트 를 주변 온도 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 미 결합 HRP 포합 된 항체 를 제거 한 후 에 플레이트 를 5 회 세척 하 고 , 각 웰 에 100 μ L / 웰 의 테트라 메틸 벤지딘 ( TMB ) ( BioFX Laboratories , Owings Mills , MD ) 을 첨가 한 후 , 플레이트 를 주변 온도 에서 3 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 색 발생 을 100 μ L / 웰 의 450 nm TMB 중지 시약 ( BioFX Laboratories , Owings Mills , MD ) 을 첨가 함 으로써 중지 시키 고 , 웰 의 흡광도 를 450 nm 에서 Molecular Devices Spectra MAX 340 기기 상 에서 판독 한다 .