hESC 세포 덩어리 ( clump ) 를 8 ng / ml 의 b - FGF ( basic fibroblast growth factor ) 가 포함 된 배양 보조 세포 - 조건 화 배지 ( feeder cell - conditioned media ) 와 함께 매트리 젤 - 코딩 디쉬 ( matrigel - coated dish ) 에 넣 어 37 ℃, 5 % 인큐베이터 에서 3 일 동안 배양 하 였 다 . 이후 , hESC 의 배지 는 50 ng / ml activin A ( Peprotech ) 및 1 % B 27 supplement ( Life Technologies ) 를 포함 한 RPMI - 1640 배지 로 5 일 동안 24 시간 간격 으로 교체 하 여 hESC 를 DE ( definitive endoderm ) 으로 유도 하 였 다 . 이후 , 1 % B 27 , 30 ng / ml FGF 4 ( Fibroblast growth factor 4 ) 및 20 ng / ml BMP 2 ( bone morphogenetic protein 2 ) 가 포함 된 RPMI - 1640 배지 로 5 일 동안 24 시간 간격 으로 교체 하 여 초기 간세포 ( early hepatocyte ) 로 유도 하 였 다 . 분화 10 일 째 의 초기 간세포 는 리플 레이팅 ( replating ) 과정 을 거쳤 다 . 구체 적 으로 초기 간세포 에 EDTA 를 2 분 간 처리 하 고 , 10 % FBS 가 포함 된 DMEM 배지 로 세포 를 모은 후 , 1500 rpm 에서 2 분 동안 원심 분리 하 고 , 상층 액 을 제거 한 후 , HCM ( hepatocyte culture , medium , Lonza ) 배지 를 넣 어 주 었 다 . 상기 HCM 배지 에 는 1 % ITX ( Insulin , transferrin , selenium , Sigma ) , 10 ng / ml Oncostatin M ( peprotech ) , 10 ng / ml FGF 4 ( peprotech ) , 10 ng / ml HGF ( Hepatocyte growth factor , peprotech ) 및 100 nM dexamethasone ( sigma ) 이 포함 된 배지 를 사용 하 였 다 . 이후 , 1200 rpm 에서 2 분 동안 원심 하 고 , HCM 배지 를 넣 은 후 세 포수 를 측정 하 였 다 . 이후 , 매트리 젤 - 코딩 된 96 - well plate 에 7 . 5 x 104 cells / well 로 플 레이팅 하 였 다 . 이틀 에 한 번 씩 배지 를 교환 하 여 최종 분화 세포 ( D 19 간세포 ) 를 얻 었 다 ( 도 1 ) .