이 를 극복 하 기 위한 방 안 으로 미국 특허 제 5 , 766 , 897 호 및 국제 특허 공보 제 WO 00 / 42175 호 에서 는 PEG - 말레 이미드 를 사용 하 여 PEG 를 단백질 의 시스테인 ( Cys ) 에 선택 적 으로 PEG 를 접합 하 는 방법 을 개시 되 어 있 다 . 시스테인 특이 적 PEG 접합 반응 을 통하 여 PEG 를 단백질 에 결합 하 기 위해서 는 디 설파이드 결합 ( disulfide bonding ) 에 관여 하 지 않 는 자유 시스테인 ( free cysteine ) 이 있 어야 한다 . 인간 과립구 콜로니 자극 인 자 ( G - CSF ) 에 는 5 개 의 시스테인 ( cysteine ) 이 존재 하 는데 각각 N - 36 번 과 42 번 시스테인 간 ( 천연 형 G - CSF 기준 ) , N - 64 번 과 74 번 시스테인 간 ( 천연 형 G - CSF 기준 ) 에 는 디 설파이드 결합 이 형성 되 어 있 고 , 17 번 시스테인 만 이 자유 시스테인 이 다 . 2 개 디 설파이드 결합 ( 36 번 - 42 번 , 64 번 - 74 번 ) 은 과립구 콜로니 자극 인 자 의 구조 형성 과 생물학 적 활성 유지 에 결정 적 인 역할 을 하 며 , 17 번 시스테인 은 세린 ( serine ) 으로 교체 되 어도 과립구 콜로니 자극 인 자 의 생물학 적 활성 에 영향 를 주 지 않 으므로 천연 구조 형성 과 생물학 적 활성 에 는 기여 를 하 지 않 는 것 으로 알려져 있 다 ( winfield 등 : Biochem . J . 256 , 1988 , 213 ) . 그러나 Piget 등 은 17 번 시스테인 이 반응 조건 에 따라 분자 간 디 설파이드 결합 ( intermolecular disulfide bond ) 이나 분자 내 디 설파이드 결합 ( intramolecular disulfide bond ) 을 형성 하 여 리폴 딩 ( refolding ) 을 방해 할 뿐 아니 라 G - CSF 의 생물학 적 활성 과 안정 성 을 낮출 가능 성 이 있 다고 보 고 하 고 있 다 ( Proc . Natl . Acad . Sci . U . S . A . , 83 , 1986 , 7643 ) .