TH 세포 상의 CD 40 리간드 에 의한 , 항원 제시 세포 상 에서 발견 되 는 CD 40 수용체 의 가교 는 다양 한 하류 효과 를 유도 할 수 있 다 ( Chatzigeorgiou et al . , 2009 BioFactors ( Oxford , England ) 35 ( 6 ) : 474 - 83 ) . CD 40 바이오 어세 이 키트 ( 프로 메 가 , 카탈로그 번호 CS 1979 A 06 ) 를 , 본질 적 으로 제조 업체 에 의해 공급 된 설명서 에 따라 사용 하 여 , 항 - CD 40 항체 SGN 40 및 CP 870893 의 상이 한 변이체 를 사용 하 여 CD 40 신호 전달 에 대한 돌연변이 K 326 W / E 333 S / E 430 G 의 효과 를 시험 하 였 다 . 인간 CD 40 및 NFAT 반응 요소 하류 의 루시 페라 제 리포터 유전자 를 안정 하 게 발현 하 는 쏘 - 앤 - 유즈 글 로리스 판스 NF κ B - luc 2 P / U 20 S 세포 는 CD 40 활성 화 시 루시 페라 제 를 발현 한다 . 25 μ L 의 새로 해동 된 세포 를 96 - 웰 백색 F - 바닥 옵 티 플레이트 ( 퍼킨 엘머 , 카탈로그 번호 6005299 ) 내 25 μ L RPMI 1640 배지 ( 프로 메 가 , 카탈로그 번호 G 708 A ) 에서 8 % 태아 소 혈청 ( J 1211 ) 의 존재 하 에 밤새 인 큐 베이 션 하 였 다 . 다음 날 , 연속 희석 물 의 항체 또는 정제 된 재조합 CD 40 리간드 ( 알 앤디 시스템즈 ( R & D systems ) , 카탈로그 번호 6420 - CL - 025 / CF ) 를 80 μ L 의 최종 부피 로 배지 내 세포 에 첨가 하 였 다 . 세포 를 추가 5 시간 동안 인 큐 베이 션 한 후 , 바이오 - 글 로 시약 ( 프로 메 가 , 카탈로그 번호 CS 197704 ) 을 첨가 하 였 다 . 주위 온도 에서 5 - 10 분 인 큐 베이 션 한 후 , 엔 비전 멀티 라벨 플레이트 판독기 를 사용 하 여 발광 을 기록 하 였 다 . 태아 소 혈청 ( FBS , 프로 메가 Ref . J 121 A ) 을 혈청 공급원 으로서 사용 하 였 다 . 0 . 1 내지 25 , 000 ng / mL 범위 의 연속 희석 물 로 항체 를 시험 하 였 다 . CD 40 반응 검정 에서 양성 대 조군 으로서 사용 된 재조합 CD 40 리간드 ( 0 . 04 내지 10 , 000 ng / mL 범위 의 연속 희석 물 ) 는 비 - 결합 음성 대 조군 항체 IgG 1 - b 12 에 비해 명확 한 반응 신호 를 유도 하 였 다 ( 도 32 ) . 야생 형 항 - CD 40 항체 IgG 1 - SGN 40 은 음성 대 조군 항체 IgG 1 - b 12 와 본질 적 으로 유사 한 CD 40 반응 수준 을 유도 하 였 다 . 대조 적 으로 , 세포 표면 결합 후 항체 사이 의 Fc - Fc 상호 작용 을 유도 하 는 E 430 G 돌연변이 만 을 함유 한 IgG 1 - CD 40 - SGN 40 변이체 는 CD 40 반응 을 유도 하 였 다 ( EC 50 336 . 4 ± 15 . 3 SD ng / mL ) . C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 K 326 W / E 333 S 와 조합 된 E 430 G Fc - Fc - 증진 돌연변이 를 갖 는 IgG 1 - CD 40 - SGN 40 변이체 는 IgG 1 - SGN 40 의 효력 을 추가 로 증진 시켰 다 ( EC 50 18 . 0 ± 1 . 1 SD ng / mL ) . 야생 형 항체 IgG 1 - CD 40 - CP 870893 은 이미 CD 40 반응 을 유도 할 수 있 으며 ( EC 50 187 . 4 ± 9 . 2 SD ng / mL ) , 이 는 K 326 W / E 333 S / E 430 G ( EC 50 45 . 9 ± 3 . 3 SD ng / mL ) 에 의해 CD 40 리간드 와 유사 한 수준 으로 추가 로 강화 될 수 있 었 다 .