온도 감수성 돌연변이 cI 857 유전자 를 가지 고 있 는 대장균 pop 2136 의 게놈 을 Not I 으로 무작위 적 으로 자른 후 주형 으로 사용 하 였 다 . 　 N - 터 미 날 프라이머 로 는 cI 857 의 ATG 부분 과 CJ 1 프로모터 의 C - 터 미 날 사이 에 제한 효소 인 EcoRV 가 인지 할 수 있 는 서열 를 삽입 하 여 EcoRV 에 의해 소화 될 수 있 게 제작 하 였으며 C - 터 미 날 프라이머 는 cI 857 의 C - 터 미 날 쪽 으로 제작 하 였 다 . 그리 하 여 CJ 1 프로모터 하 에 cI 857 이 발현 할 수 있 게 제작 하 였 다 . 1 차 PCR 은 CCF ( 서열 번호 : 22 ) , cIB 프라이머 ( 서열 번호 : 19 ) 와 PCR 의 조건 은 각각 0 . 4 mM 의 상기 의 프라이머 , 주형 , 10 mM 트리스 완충액 ( Tris - HCl , pH 8 . 3 ) , 50 mM KCl , 2 mM MgCl 2 , 0 . 2 mM dATP , 0 . 2 mM dGTP , 0 . 2 mM dCTP , 0 . 2 mM dTTP 및 Puf 중합효소 5 효소 단위 ( unit ) 를 포함 하 도록 50 mL 를 조제 하 였 다 . 이어 반응 액 을 94 ℃ 1 분 , 50 ℃ 1 분 , 68 ℃ 에서 1 분 의 조건 으로 25 회 수행 후 68 ℃ 에서 7 분 간 PCR 을 수행 하 였 다 . 1 차 PCR 산물 과 상동 부위 를 지니 도록 제작 된 프라이머 인 CJ 1 F ( 서열 번호 : 2 ) 와 CCB ( 서열 번호 : 23 ) 를 이용 하 여 PCR 을 수행 하 였 다 . PCR 조건 은 상기 의 1 차 PCR 조건 과 동일 하 였 다 . 1 차 PCR 산물 과 2 차 PCR 산물 을 주형 으로 하 는 재조합 PCR 과정 을 거쳐 최종 적 으로 만들 어 진 PCR 산물 을 CJ 1 - SC 1 이 라 명명 하 였 다 . 전체 적 인 제작 과정 은 도 10 에 나타내 었 다 . 프라이머 는 CJ 1 F 와 cIB 를 이용 하 였으며 , PCR 조건 은 상기 와 동일 하나 각 사이클 당 증폭 시간 을 2 분 으로 늘렸 다 .