PCR III : PCR I 및 PCR II 의 생성물 3 μ l 를 사용 하 여 이 들 두 생성물 을 프라이머 부재 PCR 에 의해 결합 시켰 다 . 1 x 퓨 션 HF 완충액 중 0 . 2 mM dNTP , 1 U 의 퓨 션 DNA 폴리머 라 제 ( 핀 자임 ) 를 갖 는 45 μ l 의 혼합물 중 에서 연장 을 수행 하 였 다 . 반응 혼합물 을 95 ℃ 에서 3 분 간 가열 한 다음 , 95 ℃ 에서 30 초 및 72 ℃ 에서 45 초 의 10 주기 를 수행 하 였 다 . 이 들 중복 연장 생성물 을 증폭 시키 기 위해 , 5 μ l 의 프라이머 혼합물 ( 3 μ l 의 물 , 1 μ l 의 5 μ M EcoRI 알파 1 프라이머 및 1 μ l 의 5 μ M EcoRIPLE + ER 2 또는 EcoRIPLE 2 프라이머 ) 을 가하 였 다 . 생성물 을 20 PCR 주기 ( 95 ℃ 30 초 , 57 ℃ 30 초 , 72 ℃ 1 분 ) 및 72 ℃ 에서 7 분 간 단일 온도 정지 에 의해 증폭 시켰 다 .