당 조작 된 항체 의 제조 를 위해 , 2 개 의 추가 플라스미드 , 즉 융합 GnTIII 폴리펩타이드 발현 을 위한 추가 플라스미드 ( GnT - III 발현 벡터 ) 및 만노 시 다제 II 발현 을 위한 추가 플라스미드 ( 골지 만 노시 다제 II 발현 벡터 ) 를 각각 4 : 4 : 1 : 1 의 비 로 사용 하 여 세포 를 동시 - 형질 감염 시켰 다 . 10 % FCS 로 보충 된 DMEM 배양 배지 를 사용 하 여 세포 를 T 플라스크 내 에서 부착 된 단일 층 배 양물 로서 성장 시키 고 , 세포 가 50 % 내지 80 % 전면 성장 ( confluent ) 상태 일 때 상기 세포 를 형질 감염 시켰 다 . T 150 플라스크 의 형질 감염 을 위해 , 1500 만 개 의 세포 들 을 형질 감염 24 시간 전 에 FCS ( 최종 10 % 부피 / 부피 ) 로 보충 된 25 ㎖ 의 DMEM 배양 배지 에 시 딩 하 고 , 상기 세포 들 을 5 % CO 2 대기 를 갖 는 37 ℃ 의 항온 처리 기 내 에 밤새 넣 어 두 었 다 . 각각 의 T 150 플라스크 가 형질 감염 되 도록 , 경쇄 발현 벡터 와 중쇄 발현 벡터 사이 에 동일 하 게 나누 어 진 총 94 ㎍ 의 플라스미드 벡터 DNA , 469 ㎕ 의 최종 부피 까지 의 물 및 469 ㎕ 의 1 M CaCl 2 용액 을 혼합 하 여 DNA , CaCl 2 및 물 로 구성 된 용액 을 제조 하 였 다 . 이 용액 에 938 ㎕ 의 50 mM HEPES , 280 mM NaCl 및 1 . 5 mM Na 2 HPO 4 용액 ( pH 7 . 05 ) 을 첨가 하 고 , 즉시 10 초 동안 혼합 하 고 실온 에서 20 초 동안 방치 하 였 다 . 생성 된 현탁액 을 2 % FCS 로 보충 된 10 ㎖ 의 DMEM 으로 희석 하 고 기존 배지 대신 에 T 150 에 첨가 하 였 다 . 이어서 , 추가 13 ㎖ 의 형질 감염 배지 를 첨가 하 였 다 . 세포 를 37 ℃ 및 5 % CO 2 에서 약 17 시간 내지 20 시간 동안 항온 처리 한 후 , 배지 를 25 ㎖ 의 DMEM ( 10 % FCS ) 으로 교체 하 였 다 . 배지 를 교체 한 지 약 7 일 후 210 x g 에서 15 분 동안 원심 분리 하 여 컨 디셔 닝 된 배양 배지 를 수거 하 고 , 용액 을 멸균 여과 하 고 ( 0 . 22 ㎛ 필터 ) , 나트륨 아지드 를 0 . 01 중량 / 부피 % 의 최종 농도 로 첨가 하 고 4 ℃ 에서 유지 하 였 다 .