sgRNA 및 tRNA - sgRNA 를 설계 하 기 위해 , 벼 유전자 MKK 4 에서 타 겟 부위 GACGTCGGCGAGGAAGGCCTCGG 를 선택 하 였 다 . 이 타 겟 부위 는 도 5 에 나타낸 바 와 같이 가능 한 오프 - 타 겟 부위 ( off - target site ) 를 2 곳 가지 고 있 다 . sgRNA 또는 tRNA - sgRNA 를 발현 하 기 위한 벡터 및 WTSpCas 9 , eSpCas 9 ( 1 . 0 ) , eSpCas 9 ( 1 . 1 ) 및 SpCas 9 - HF 1 을 발현 하 기 위한 벡터 를 각각 벼 프로 토플 라스트 에 공동 - 형질 전환 하 였 다 . 형질 전환 하 고 2 일 후 , 프로 토플 라스트 DNA 를 추출 하 고 , 특이 적 인 프라이머 를 사용 해 타 겟 부위 와 오프 - 타 겟 부위 의 게놈 단편 들 을 증폭 시켰 다 . 이 들 3 가지 부위 에서 돌연변이 비율 을 2 세대 서열 분석 기법 으로 분석 하 였 다 .