세포 배양 상청 액 중 의 항체 및 유도체 의 농도 를 단백질 A 아가로오스 - 비즈 ( Protein A Agarose - beads ) ( Roche ) 로 의 면역 침전 에 의해 추정 하 였 다 . 60 ㎕ 단백질 A 아가로오스 비즈 를 TBS - NP 40 ( 50 mM 트리스 , pH 7 . 5 , 150 mM NaCl , 1 % Nonidet - P 40 ) 으로 3 회 세척 하 였 다 . 이후 1 ~ 15 mL 세포 배양 상청 액 을 TBS - NP 40 으로 예 비평 형 화 된 단백질 A 아가로오스 비즈 에 적용 하 였 다 . 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 한 후 , 비즈 를 Ultrafree - MC - 필터 컬럼 ( Amicon ) 상 에서 0 . 5 mL TBS - NP 40 으로 1 회 , 0 . 5 mL 2 x 인산염 완충 생리식염수 ( 2 xPBS , Roche ) 로 2 회 , 및 0 . 5 mL 100 mM Na - 시트 레이트 ( pH 5 . 0 ) 로 간단히 4 회 세척 하 였 다 . 결합 된 항체 를 35 ㎕ NuPAGE LDS 샘플 완충액 ( Invitrogen ) 을 첨가 하 여 용리 하 였 다 . 샘플 의 절반 을 각각 NuPAGE 샘플 환원제 와 조합 하 거나 , 또는 비 환원 된 상태 로 두 고 , 70 ℃ 에서 10 분 동안 가열 하 였 다 . 그 결과 로서 , 5 ~ 30 ㎕ 를 4 ~ 12 % NuPAGE 비스 - 트리스 SDS - PAGE ( Invitrogen ) ( 비 환원 된 SDS - PAGE 에 대해서 는 MOPS 완충액 을 사용 하 고 , 환원 된 SDS - PAGE 에 대해서 는 NuPAGE 항산화제 영동 완충액 첨가제 ( Invitrogen ) 를 갖 는 MES 완충액 을 사용 ) 에 적용 하 고 , 쿠마시 블루 ( Coomassie Blue ) 로 염색 하 였 다 .