절반 - 면적 ELISA 플레이트 ( Costar ™) 를 0 . 5 μ g / mL r - Tau 또는 p - Tau 의 웰 당 25 μ L 로 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 피복 하 였 다 . 상기 플레이트 를 BioTek ® 플레이트 워 셔 를 사용 하 여 PBST 로 3 회 세척 하 였 다 . 이어서 , 이 플레이트 를 PBSA 의 웰 당 100 μ L 로 실온 에서 1 시간 동안 차단 시켰 다 . PBST 로 세 번 씻 은 후 , 세포 형질 - 발현 된 Fab 를 첨가 하 고 ( 웰 당 25 μ L ) , 플레이트 를 1 시간 동안 항온 처리 하 였 다 . 이어서 , 이 플레이트 를 PBST 로 3 회 세척 하 고 , 1 : 5 , 000 희석 된 HRP - 접합 된 토끼 항 - 인간 카파 ( Bethyl Laboratories 로부터 입수 ) 를 함유 하 는 PBSA 를 웰 당 25 μ L 를 첨가 하 였 다 . 상기 플레이트 를 실온 에서 30 분 동안 항온 처리 한 다음 , PBST 로 3 회 세척 하 였 다 . 상기 플레이트 는 웰 당 TMB 기질 을 25 μ L 를 첨가 하 여 ( Thermo Fisher 로부터 입수 ) 발달 시켰 고 , 2 N H 2 SO 4 로 퀀칭 되 었 다 . 신호 는 A 450 에서 BioTek ® 플레이트 리더 에서 정량 화 되 었 다 . r - Tau 와 p - Tau 모두 백그라운드 보다 5 - 배 이상 의 신호 를 갖 는 웰 은 양성 으로 간주 되 었 고 , ( ELISA 의 반복 에 의한 ) 결합 및 가변 영역 의 서열 확인 을 위해 클론 을 1 차 배 양물 로부터 재 - 배열 되 었 다 .