발현 되 고 분비 된 단일 특이 적 , 2 가 < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 를 공지 된 표준 방법 에 따라 단백질 A 친화성 크로마토그래피 에 의해 , 여과 된 세포 배양 상청 액 으로부터 정제 하 였 다 . 요약 하 여 , 일시 적 트랜스펙션 으로부터 < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 를 함유 하 는 세포 배양 상청 액 을 원심 분리 ( 10 분 동안 10 , 000 g ) 및 0 . 45 ㎛ 필터 를 통한 여과 로 깨끗이 하 고 , PBS 완충액 ( 10 mM Na 2 HPO 4 , 1 mM KH 2 PO 4 , 137 mM NaCl 및 2 . 7 mM KCl , pH 7 . 4 ) 으로 평형 화 된 단백질 A HiTrap MabSelect Xtra 컬럼 ( GE Healthcare ) 에 적용 하 였 다 . 비 결합 된 단백질 을 PBS 평형 완충액 , 이후 0 . 1 M 나트륨 시트 레이트 완충액 ( pH 5 . 5 ) 으로 세척 하 여 제거 하 고 , PBS 로 세척 하 였 다 . < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 를 100 mM 나트륨 시트 레이트 ( pH 2 . 8 ) 로 용리 한 후 , 2 ml 분획 당 300 ㎕ 2 M 트리스 ( pH 9 . 0 ) 로 샘플 을 즉각 적 으로 중화 하 였 다 . 응집 된 단백질 을 20 mM 히스티딘 , 150 mM NaCl ( pH 6 . 0 ) 에서 의 HiLoad 26 / 60 Superdex 200 프 렙 그레이드 컬럼 ( GE Healthcare ) 상 에서 크기 배제 크로마토그래피 에 의해 단량체 성 항체 로부터 분리 하 고 , 단량체 적 항체 분획 을 이후 MILLIPORE Amicon Ultra - 15 원심 분리 농축기 를 사용 하 여 농축 하 였 다 . < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 를 - 20 ℃ 또는 - 80 ℃ 에서 동결 및 보관 하 였 다 . < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 의 무결 성 을 환원제 의 존재 또는 부재 하 에서 SDS - PAGE 에 의해 분석 하 고 , 이후 실시 예 1 D 에서 기재 된 바 와 같이 쿠마시 브릴리언트 블루 로 염색 하 였 다 . 정제 된 < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 는 LC * 경쇄 에 상응 하 는 약 25 kDa 의 밴드 , 및 각각 의 HC * 중쇄 에 상응 하 는 50 kDa 의 밴드 를 갖 는 전형 적 IgG 1 항체 와 같이 거동 하 였 다 . 비 환원 된 상태 에서 는 , 완전 한 항체 에 대해 약 150 kDa 에서 밴드 를 관찰 할 수 있 었 다 . < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 의 응집 및 올리고머 성 상태 를 분석 적 크기 배제 크로마토그래피 로 분석 하 고 , 정제 된 Fab 교차 항체 가 단량체 성 상태 라는 것 을 나타내 었 다 . 분석 한 샘플 을 후속 단백질 분석 및 기능 적 분석 을 위해 제공 하 였 다 . ESI 질량 분석기 를 사용 하 여 , 주요 종류 로서 완전히 탈 글 리코 실화 된 < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 의 이론 적 분자량 을 확인 하 였 다 ( 중쇄 의 C - 말단 라이신 잔기 없이 , 및 경쇄 의 C - 말단 피 로 글루 타 메이트 잔기 를 가지 고 계산 하 였 음 ) ( 도 22 ) .