라 이게 이 션 믹스 를 사용 하 여 XL 1 - Blue 또는 DH 5 알파 수용성 세포 를 형질 전환 시켰 다 . 양성 클론 을 DNA 서열 결정 에 의해 입증 하 였 다 . 상기 구성체 및 pAmber - AcPheRS 를 동시 - 형질 전환 시키 고 , KS 474 , TG 1 ( -), BL 21 ( DE 3 ) 및 DH 10 B 를 포함 한 몇몇 이 . 콜라 이 종 에서 발현 시켰 고 , 배지 는 1 mM p - 아세틸 - L - 페닐알라닌 을 함유 하 였 다 . 유도 및 발현 후 에 , 세포 펠 렛 을 - 20 ℃ 에서 동결 시킨 후 , 용해 버퍼 ( 20 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM 이미다졸 , 500 mM NaCl , 50 ml 버퍼 당 EDTA 가 없 는 Complete ( 로슈 ) 1 정제 , 2 mM MgCl 2 , 10 U / ml 벤조 나제 ( 머크 ) [ pH 7 . 4 ] ) 내 에 재현 탁 시켰 다 . 세포 를 얼음 상 에서 초음파 분해 하 고 , 원심 분리 하 였 다 . 상등 액 을 여과 하 고 Ni - NTA 컬럼 상 으로 로딩 하 였 다 . 컬 럼 을 세척 버퍼 ( 용해 버퍼 와 같 지만 20 mM 이미다졸 을 함유 함 ) 로 세척 한 후 , 용출 버퍼 ( 용해 버퍼 와 같 지만 500 mM 까지 의 이미다졸 을 함유 함 ) 로 용출 하 였 다 . 샘플 을 Bis - Tris 겔 ( 인비 트로겐 ) 상 에서 분석 한 후 , Amicon Ultra - 15 튜브 내 에서 농축 시키 고 , 수퍼 덱스 프 렙 등급 컬럼 ( 아머샴 ) 상 으로 로딩 하 고 , 10 mM Tris 로 용출 하 였 다 . 샘플 을 다시 Bis - Tris 겔 상 에서 분석 하 였 다 . 정제 된 단백질 을 100 mM 아세트산나트륨 ( pH 5 . 5 ) 에 대해 투석 하 고 , 약 2 시간 동안 실온 에서 5 내지 10 몰 과량 의 PEG - 히드라지드 와 커플링 시켰 다 . PEG 화 의 효율 을 SDS - PAGE 및 SEC 에 의해 분석 하 였 다 . 이어서 , 농축 된 Tris 를 사용 하 여 pH 를 증가 시키 고 , 과잉 의 PEG 는 Ni - NTA 크로마토그래피 에 이어서 PBS 또는 Tris 를 사용 한 투석 에 의해 제거 하 였 다 .