레바 우디 오시드 A 에 대한 조작 된 라운드 10 변이체 의 활성 을 특성 화 하 기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험 을 수행 하 였 다 . 0 . 002 - 0 . 2 g / L 수준 의 진탕 플라스크 분말 ( SFP ) 을 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 6 , 8 mM 레바 우디 오시드 A , 0 . 4 mM ADP , 24 mM 수크로스 , 및 0 . 15 g / L SUS SFP 서열 번호 1764 를 함유 하 는 100 μ L 의 총 반응 부피 에 첨가 하 였 다 . 반응 은 1 시간 동안 300 RPM 에서 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 60 ℃ 에서 수행 하 였 다 . 반응물 은 물 에 1 : 20 으로 희석 한 후 , 20 μ L 의 희석 된 검정 물 을 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 80 μ L 아세 토니 트릴 에 첨가 함 으로써 켄 칭 하 고 , 4 ℃ 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 침전 시켰 다 . 상청 액 을 물 에 1 : 10 으로 희석 한 후 , RapidFire SPE - MS / MS 에 의해 스 테 비올 글리코시드 에 대해 분석 하 였 다 . 0 . 25 g / L SFP 로딩 시 에 레바 우디 오시드 A 에 대한 라운드 10 변이체 의 활성 은 표 49 . 3 에 열거 되 어 있 다 . 표 49 . 3 에 열거 된 5 개 의 모든 변이체 가 서열 번호 3016 보다 더 높 은 활성 을 가졌 다 . 돌연변이 K 58 R , I 122 L , V 176 R , T 400 V , K 425 R , S 426 A , I 427 R , 및 S 446 R ( 서열 번호 3082 ) 및 그 의 코딩 폴리뉴클레오티드 ( 서열 번호 3081 ) 를 갖 는 변이체 가 레바 우디 오시드 A 의 글 루 코 실화 를 위한 추가 의 유도 진화 를 위해 선택 되 었 다 .