그 다음 TBS - T 완충 용액 3 ㎖ 를 실리콘 용기 ( siliconized bottle ) 에 분주 하 고 여기 에 토끼 항 - 생쥐 TNF - α 다 클론 일 차 항체 ( rabbit anti - murine TNF - α polyclonal primary antibody ; PBS 완충 용액 에 500 ㎍/ 1 . 5 ㎖ 농도 ) 30 ㎕( 1 : 300 희석 비율 ) 를 각각 첨가 하 여 니트 로 셀룰로스 멤 브레인 을 실리콘 용기 ( siliconized bottle ) 에 넣 은 후 4 ℃ 로 맞춘 하이브 리디 제이션 반응기 ( hybridization incubator ; 미국 Robbins 사 제품 ) 에서 10 rpm 속도 로 12 시간 동안 반응 시켰 다 . 그리고 나 서 TBS - T 완충 용액 70 ㎖ 을 사용 하 여 20 분 동안 각각 3 번 하이 브리디 제이션 반응기 에서 12 rpm 속도 로 씻 어 내 고 이 차 항체 로서 염소 항 - 토끼 IgG 퍼 옥시 다제 결합 항체 ( goat anti - rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody ; 스톡 용액 은 PBS 완충 용액 에 0 . 02 ㎎/ 4 ㎖ 농도 ) 를 친화성 분리 하 여 3 ㎖ TBS - T 완충 용액 에 30 ㎕ ( 1 : 20 , 000 희석 비율 ) 을 첨가 한 다음 4 ℃ 로 맞춘 하이브 리디 제이션 반응기 에서 3 시간 동안 배양 하 고 다시 70 ㎖ TBS - T 완충 용액 을 사용 하 여 20 분 동안 각각 4 회 세척 하 였 다 . 그 다음 니트 로 셀룰로스 멤 브레인 을 얇 고 투명 한 비닐 에 넣 고 퍼 옥시 다제 기질 ( ECL ; peroxidase substrate ) 반응 용액 1 및 반응 용액 2 를 50 % 씩 혼합 한 반응 용액 3 ㎖ 을 이 위 에 분주 하 고 5 분 동안 배양 하 였 다 . 반응 이 끝난 다음 암실 ( 10 W 안전 램프 ; 미국 Kodak 사 제품 ) 에서 NC 가 들 어 있 는 카세트 에 X - 선 필름 을 끼우 고 5 분 또는 10 분 이상 감광 시킨 후 X - 선 필름 현상 용 박스 안 의 현상 용액 ( develop solution ) 에 약 3 분 동안 넣 어 반응 시킨 후 , 이 X - 선 필름 을 다시 2 분 동안 물 로 씻 은 다음 고정 용액 ( fixing solution ) 에서 3 분 동안 반응 시키 고 다시 2 분 동안 물 로 씻 어 나타나 는 밴드 를 분석 하 였 다 .