HBEC 를 그레이 ( Gray ) 및 그 의 동료 의 1996 년 문헌 에 기재 된 방법 을 변형 시켜 배양 하 였 다 . 세포 를 플라스틱 T - 162 플라스크 에 시 딩 하 고 , 소 뇌하수체 추출물 ( 52 ㎍/ mL ) , 히드로코르티손 ( 0 . 5 ㎍/ mL ) , 인간 재조합 표피 성장 인자 ( 0 . 5 ng / mL ) , 에피네프린 ( 0 . 5 ㎍/ mL ) , 트랜스페린 ( 10 ㎍/ mL ) , 인슐린 ( 5 ㎍/ mL ) , 레티 노산 ( 0 . 1 ㎍/ mL ) , 트리 요오 도티 로 닌 ( 6 . 5 ㎍/ mL ) , 겐타마이신 ( 50 ㎍/ mL ) 및 암포 테 리신 B ( 50 ng / mL ) 가 보충 된 기관지 상피 세포 성장 배지 ( BEGM ; 캄 브렉스 ) 에서 성장 시켰 다 . 세포 가 90 ％ 전면 생장 할 때 까지 배지 를 매 48 시간 마다 교체 하 였 다 . 이어서 , 세포 를 계대 배양 하 고 , 상기 와 동일 하 게 보충 되 었 지만 , 트리 요오 도티 로 닌 은 없 고 레티 노산 의 최종 농도 가 50 nM ( 모두 트랜스 - 레티 노산 ) 인 BEGM 중 50 ％ DMEM 을 함유 하 는 분화 배지 에서 폴리 카르보 네이트 스냅 웰 ( Snapwell ) 삽 입체 ( 코스타 ( Costar ) ) 상 에 시 딩 하 였 다 ( 8 . 25 x 105 세포 / 삽 입체 ) . 처음 7 일 동안 은 세포 가 배 양물 에 잠기 도록 유지 하 였 고 , 그 후 나머지 배양 기간 동안 에 는 세포 를 선단 공기 계면 에 노출 시켰 다 . 그 후 , 나머지 배양 동안 에 는 배지 를 2 ％ v / v 울트 로저 ( Ultroser ) G 를 함유 하 는 DMEM : F 12 배지 로 교체 하 였 다 . 우 씽 챔버 ( Ussing Chamber ) 에서 사용 하 기 전 에 모든 배지 3 공급 물 로부터 암포 테 리신 B 를 제거 하 였 다 . 선단 - 공기 계면 이 수립 된 후 7 내지 21 일 사이 에 세포 를 사용 하 였 다 . 모든 배양 단계 에서 , 세포 를 37 ℃ 에서 5 ％ CO 2 중 에서 공기 인큐베이터 에서 유지 시켰 다 .