레바 우디 오시드 A 로부터 레바 우디 오시드 D 의 형성 을 용이 하 게 하 기 위한 조작 된 라운드 12 SuS 변이체 의 수크로스 및 ADP 에 대한 활성 을 특성 화 하 기 위해 실험 을 수행 하 였 다 . 진탕 플라스크 분말 ( SFP ) 을 인산칼륨 완충제 , pH 6 에 0 . 03 - 1 g / L 로 만들 고 , 분취 액 을 15 분 동안 열 순환기 에서 68 ℃ 에서 예비 인 큐 베이 팅 하 였 다 . 이어서 , 예비 인 큐 베이 팅 되 거나 되 지 않 은 10 μ L 의 상기 SFP 희석 액 을 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 6 , 15 mM 레바 우디 오시드 A ( > 97 % 순도 ) , 37 . 5 mM 수크로스 , 9 mM 프럭토스 , 0 . 2 mM ADP , 및 0 . 5 g / L GT 서열 번호 4256 을 함유 하 는 100 μ L 의 총 반응 부피 에 첨가 하 였 다 . 반응 은 예비 인 큐 베이 팅 되 지 않 은 SFP 샘플 에 대해서 는 55 ℃ 에서 , 예비 인 큐 베이 팅 된 SFP 에 대해서 는 60 ℃ 에서 4 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 수행 하 였 다 . 반응물 을 물 에 40 배 희석 함 으로써 가용화 하 고 , 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 아세 토니 트릴로 10 배 희석 함 으로써 켄 칭 하 고 , 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 상청 액 은 물 에 3 . 3 배 희석 한 후 , 표 31 . 1 에 기재 된 기기 및 파라미터 를 사용 하 여 RapidFire SPE - MS / MS 에 의해 스 테 비올 글리코시드 에 대해 분석 되 었 다 . 동결 건조 전 에 맑 아 진 진탕 플라스크 용해 물 을 사용 하 여 추가 의 열 안정 성 특성 결정 을 다음 과 같이 수행 하 였 다 : 용해 물 을 완충제 로 400 배 희석 하 고 , 16 - 18 시간 동안 55 - 70 ℃ 의 구배 로 열 순환기 에서 인 큐 베 이 팅 하 였 다 . 남 아 있 는 % 활성 을 결정 하 기 위해 , 예비 인 큐 베이 팅 된 용해 물 을 스테비오 시드 또는 레바 우디 오시드 D 및 55 ℃ 에서 의 4 시간 인 큐 베이 션 을 사용 하 여 상기 기재 된 바 와 같이 검정 하 였 다 . 남 아 있 는 % 활성 은 고온 에서 의 활성 을 예비 인 큐 베이 팅 된 최저 온도 에서 의 활성 으로 나눈 값 으로 나타냈 다 . 표 38 . 3 에 나열 된 7 개 의 모든 변이체 는 예비 인 큐 베이 팅 된 조건 하 에서 서열 번호 2064 보다 더 높 은 활성 을 가졌 고 , 2 개 의 변이체 는 또한 55 ℃ 조건 하 에서 덜 유해 하 였 다 . 서열 번호 2064 와 비교 하 여 모든 조건 하 에서 개선 된 돌연변이 P 57 W , L 562 I , 및 R 711 K ( 서열 번호 2432 ) 를 갖 고 라운드 10 포화 돌연변이 유발 스크린 으로부터 의 상위 돌연변이 를 함유 하 는 변이체 가 글루코스 를 수크로스 로부터 ADP 로 전달 하 는 재순환 반응 의 촉매 작용 을 위한 추가 의 유도 진화 를 위해 선택 되 었 다 .