에 피토프 특성 화 : OX 40 의 1 - 235 아미노산 서열 ( 세포 외 및 막 횡단 도메인 ) 및 CD 40 의 216 - 278 아미노산 서열 ( 세포내 도메인 ) 에 상응 하 는 재조합 인간 OX 40 - CD 40 융합 구축물 을 발현 하 는 300 - 19 세포 가 항체 에 피토프 분석 에 사용 되 었 다 . OX 40 - CD 40 발현 세포주 를 10 ％ 송아지 태아 혈청 ( Hyclone ( Logan , UT ) ) , 10 mM HEPES , 1 ％ 페니실린 - 스트렙토마이신 , 2 mM L - 글루타민 , 0 . 1 mM 비 - 필수 아미노산 및 0 . 05 mM 2 - 메르 캅 토 에탄올 ( Gibco ( Grand Island , NY ) ) 이 보충 된 RPMI 배지 ( Gibco ( Grand Island , NY ) ) 에서 성장 시켰 다 . 300 - 19 . hCD 134 . 2 세포 ( 5 × 105 개 / 튜브 ) 를 3 ㎖ 의 저온 세정 완충제 ( PBS , 2 ％ FBS 및 0 . 02 ％ 아지드 화 나트륨 ) 에서 1 회 세정 하 였 다 . 세포 상등 액 을 흡인 하 고 , 300 ㎍/㎖ 의 1 차 미 접합 OX 40 반응 성 항체 를 함유 하 는 세정 완충제 100 ㎕ 를 세포 펠 렛 에 첨가 하 고 , 혼합 하 고 , 30 분 동안 4 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 플 루 오로크 롬 - 표지 2 차 항체 를 튜브 에 첨가 하 고 , 혼합 하 고 , 추가 로 30 분 동안 4 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . OX 40 반응 성 플 루 오로크 롬 - 표지 항체 는 10 ㎕ 의 파이 코 에 리트 린 ( PE ) - 표지 Ber Act 35 ( Caltag Laboratories ( Burlingame , CA . ) ) , PE - 표지 L 106 ( BD Pharmingen ( San Jose , CA ) ) 또는 알렉사 플루오르 ( Alexa Fluor ) 647 - 접합 OX 40 R 항체 를 포함 하 였 다 . OX 40 R 항체 를 제조사 ( Molecular Probes ( Eugene , OR ) ) 가 기술 한 바 와 같이 알렉사 플루오르 647 단백질 표지 키트 를 사용 하 여 플 루오 로 크롬 으로 표지 하 였 다 . 염색 후 , 세포 를 세정 완충제 로 3 회 세정 하 고 , 저 온 세정 완충제 에 재현 탁 시키 고 , 10 , 000 개 의 이벤트 를 수집 하 고 , 벡 톤 디킨슨 팩스 캘리버 및 셀 퀘스트 소프트웨어 ( San Jose , CA ) 를 사용 하 여 분석 하 였 다 . 1 차 항체 가 2 차 플 루 오로크 롬 - 표지 항체 의 염색 을 80 ％ 를 초과 하 여 차단 한 경우 항체 들 이 동일 한 에 피토프 에 결합 하 는 것 으로 간주 되 었 다 .