플라스미드 pGAPZ A PLE - ER , pGAPZ A PLE + ER , pGAPZ A APLE - ER 및 pGAPZ A APLE + ER 을 제한 엔 도 뉴클레아제 XhoI 으로 절단 하 고 , ER 보유 신호 를 갖 거나 갖 지 않 는 , APLE 및 PLE 단백질 을 암호 화 하 는 각각 의 단편들을 XhoI 절단 부위 를 통해 pPIC 9 벡터 ( 인비 트로겐 ) 내 에 클로닝 하 였 다 . AOX 1 프로모터 에 대한 단편 들 의 정확 한 배향 을 제한 엔 도 뉴클레아제 NcoI 을 이용 한 대 조군 절단 에 의해 확인 하 였 다 . AOX 1 프로모터 를 갖 는 벡터 는 , 실시 예 4 에서 명명 한 플라스미드 와 유사 하 게 , pPIC 9 PLE - ER , pPIC 9 PLE + ER , pPIC 9 APLE - ER 및 pPIC 9 APLE + ER 로 명명 하 고 , SalI 으로 선형 화 하 고 피치 아 파스토 리스 KM 71 에 형질 전환 시켰 다 . 형질전환 및 His 독립 영양 성 ( prototrophy ) 에 대한 선별 은 인비 트로겐 의 피 치아 발현 키트 의 지시 에 따라 수행 하 였 다 . 선별 된 형질전환 체 및 KM 71 균주 를 인비 트로겐 의 피 치아 발현 키트 에 따라 완전 배지 상 에서 밤새 배양 하 고 1 % 메탄올 을 사용 하 여 48 시간 동안 유도 하 였 다 . 생 성 배 양물 을 실시 예 7 에 기술 된 정량 적 pH - 변동 분석 을 이용 하 여 분석 하 였으며 , 이때 각 경우 에 혼합물 중 2 μ l 의 배 양물 을 시험 하 였 다 . 유도 성 AOX 1 프로모터 의 조 절하 에서 의 발현 은 , 실시 예 7 에서 의 구성 적 발현 에 대해 기술 된 상황 과 비교 하 여 , 라세미 메틸 5 - 클로로 - 2 -( 1 - 메틸 에틸 ) - 4 - 펜테 노 에이트 에 대해 훨씬 더 높 은 rAPLE 효소 활성 을 유도 하 였 다 . 페닐 레드 색 변화 ( 적색 에서 황색 으로 ) 는 단지 수분 후 에 검출 가능 하 였 다 ( 도 3 ) . 예기 치 않 게 , rAPLE 활성 은 C - 말단 에서 ER 보유 신호 HAEL 의 존재 와 무관 하 였 다 , 즉 , ER 보유 신호 를 갖 는 rAPLE 를 발현 시킨 세포 도 활성 을 나타내 었 다 . 대조 적 으로 , rPLE 를 생성 하 기 위한 효모 균주 는 라세미 메틸 5 - 클로로 - 2 -( 1 - 메틸 에틸 ) - 4 - 펜테 노 에이트 에 대한 활성 을 갖 지 않 았 다 .