질량분석기 를 통해 췌장암 및 정상인 의 혈장 시료 에서 간섭 현상 없이 안정 적 으로 분석 가능 한 54 개 단백질 , 68 펩타이드 의 대하 여 혈액 검사 를 통해 췌장암 의 진단 및 예측 을 위한 바이오 마커 를 발굴 하 기 위하 여 다기관 , 대 규모 로 이루어진 시료 를 이용 하 여 검증 분석 을 실시 하 였 다 . 기관 은 서울 아산 병원 , 국립암센터 , 삼성 서울 병원 , 서울대 병원 , 연세 세브 란스 병원 총 5 개 의 병원 이 며 , 총 검증 단계 에서 사용 된 시료 의 숫자 는 1008 개 의 혈장 시료 를 사용 하 였 다 . MRM 분석 을 위해 1008 개 의 시료 는 4 개 의 배치 ( batch ) 로 나누 었 다 . 각 배치 는 250 개 의 시료 가 배정 되 었 으며 , 4 가지 서로 다른 시료 군 들 이 비슷 한 비율 로 속하 도록 하 였 다 . 마지막 배치 에 는 8 개 를 더 하 여 258 개 의 시료 로 구성 하 였 다 . 또한 분석 의 편차 를 보정 하 기 위하 여 pooling 시료 를 각 배치 에 무작위 로 배치 하 여 양성 대 조군 으로 함께 분석 하 였 다 . 분석 에 사용 된 장비 는 액체 크로마토그래피 ( liquid chromatography ) 는 애 질 런 트 사 의 1260 - 모세관 LC 를 사용 하 고 , 펩타이드 의 분리 를 위해 모세관 RR 0 . 5 x 150 3 . 5 um 의 컬럼 을 사용 하 였 다 . 시료 는 5 ㎕ 를 주입 하 였 고 , 유속 은 20 ㎕/ 분 으로 설정 하 였 다 . 우선 컬 럼 을 Sol A ( 부피 기준 으로 95 % 증류 슈 , 5 % 아 세토 니트릴 , 0 . 1 % 포름산 ) 으로 10 분 간 평형 화 한 후 Sol B ( 95 % 아 세토 니트릴 , 0 . 1 % 포름 ) 를 50 분 간 3 %- 35 % 까지 , 10 분 간 80 % 까지 Sol B 의 비율 을 조정 하 며 마지막 10 분 동안 5 % 까지 다시 Sol B 의 비율 을 낮추 는 식 으로 농도 구배 를 가하 여 펩타이드 를 용출 하 였 다 . 분석 에 사용 된 총 LC 분석 시간 은 70 min 이 다 . 질량분석기 ( Mass spectrometer ) 로서 애 질 런 트 사 의 triple quadrupole 6490 - QQQ 장비 를 이용 하 여 선정 단백질 들 에 대한 트랜 지 션 에 대해 MRM 모드 로 모니터링 하 였 다 . 배치 ( Batch ) 간 편차 를 보정 하 기 위해 각 시료 에 스파 이킹 ( spiking ) 된 5 fmol 베타 - 갈락토시다아제 펩타이드 ( GDFQFNISR [ C 13 N 15 ] , 547 . 3 / 646 . 4 ) 도 동시 에 모니터링 하 였 다 . MRM 분석 순서 는 환자 군 이 실험 자 가 확인 할 수 없 도록 blinding 후 무작위 적 으로 분석 되 었 으며 , 분석 은 시료 당 3 번 씩 반복 분석 했 다 . 이 를 통해서 얻 어 진 마커 후보 군 에 대한 peak area 값 은 endogenous 펩타이드 의 peak area 값 을 이 와 대응 하 는 SIS 펩타이드 의 peak area 값 으로 normalization 하 여 Data 를 준비 하 였 다 . 이 데이터 를 머신 러닝 을 이용 한 다중 마커 패널 개발 에 사용 하 였 다 .