계통 발생학 적 으로 암모늄 산화 균 은 베타 프로테 오 박테리아 ( Betaproteobacteria ) 강 ( class ) 하위 의 니트 로 소모 나 다시 애 ( Nitrosomonadaceae ) 과 ( family ) 에 속하 는 암모늄 산화 균 과 감마 프로테 오 박테리아 ( Gammaproteobacteria ) 강 ( class ) 하위 의 니트 로 소코 쿠스 ( Nitrosococcus ) 속 ( genus ) 에 속하 는 암모늄 산화 균 으로 분류 되 며 , 다시 니트 로 소모 나 다시 애 ( Nitrosomonadaceae ) 과 는 16 S rRNA 유전자 ( gene ) 서열 의 상동성 에 의해 니트 로 소모 나스 유로 패 아 계통 ( Nitrosomonas europaea - lineage ) , 니트 로 소코 쿠스 모빌 리스 계통 ( Nitrosococcus mobilis - lineage ) , 니트 로 소모 나스 니트 로 사 계통 ( Nitrosomonas nitrosa - lineage ) , 니트 로 소모 나스 크리오 톨러 란스 계통 ( Nitrosomonas cryotolerans - lineage ) , 니트로소 스피라 멀티 포 미스 계통 ( Nitrosospira multiformis - lineage ) 등 의 5 개 의 하위 그룹 으로 분류 될 수 있 다 . 본 발명자 들 은 상기 그룹 의 암모늄 산화 균 의 16 S rRNA 유전자 에 상보 적 으로 결합 할 수 있 는 프라이머 및 형광 물질 이 표지 된 프로브 를 디자인 하 여 제작 하 였 다 ( 표 2 참조 ) . 감마 프로테 오 박테리아 ( Gammaproteobacteria ) 강 에 속하 는 암모늄 산화 균 은 해수 의 염분농도 조건 에서 만 생장 하 기 때문 에 담수 조건 의 일반 질산화 공정 에 존재 할 가능 성 은 거의 없 으므로 본 발명 에서 정량 대상 에 포함 시키 지 않 았 다 . 이후 , 본 발명자 들 은 디자인 한 프라이머 및 형광 물질 이 표지 된 프로브 를 이용 하 여 실시간 PCR ( real - time PCR ) 을 수행 하 였 다 . 실시간 PCR 은 순방향 과 역방향 의 프라이머 사이 에 있 는 염기 서열 을 갖 는 형광 탐 침자 ( dual labeled fluorescent probe ) 를 사용 한다 . 5 ' 말단 에 는 빛 을 발산 하 는 형광 물질 ( reporter ) 이 , 3 ' 말단 에 는 빛 을 억제 하 는 물질 ( quencher ) 이 표지 ( labeling ) 되 어 있 는데 PCR 반응 중 주형 DNA ( template DNA ) 에 붙 어 있 던 프로브 의 5 ' 말단 이 중합 반응 과정 에서 떨어져 나감 으로써 형광 이 나타나 고 이것 이 기계 에 탐지 되 게 된다 . 기존 의 정량 PCR 방법 이 반응 의 포화 상태 이전 의 지수 적 으로 증폭 된 DNA 양 을 측정 하 는 데 비해 실시간 PCR 방법 은 지수 적 인 증폭 이 일어나 는 초기 의 시료 의 양 을 형광 물질 의 지수 적 증가 가 탐지 되 기 시작 하 는 사이클 의 수 ( threshold cycle , 이하 ' Ct ' 라고 칭한다 ) 로 나타내 므로 보다 정확 한 정량 분석 방법 이 며 반응 을 실시간 으로 분석 할 수 있 다 ( Heid et al . 1996 . Genome Res . 6 : 986 - 994 . ). 상기 방법 은 겔 ( gel ) 을 전기 영동 하 여 영상분 석기 로 강도 를 측정 하 는 단계 가 생략 되 고 이 과정 이 자동 화 , 수치 화 되 므로 간편 성 과 신 속성 , 정확 성 에서 크 게 향상 된 방법 이 라고 할 수 있 다 . 실시간 PCR 수행 결과 , 각각 의 프라이머 및 프로브 셋 트 를 이용 하 여 정량 하 고자 하 는 목적 그룹 에 속하 는 미생물 만 이 선택 적 으로 증폭 되 어 검출 됨 을 확인 하 였 다 ( 도 1 내지 5 참조 ) . 이후 5 개 의 프라이머 및 프로브 셋 트 에 대하 여 각각 의 검량 곡선 을 작성 하 였 다 . 질산화 공정 으로부터 의 시료 에서 DNA 를 추출 하 고 각 프라이머 및 프로브 셋 트 를 이용 한 실시간 PCR 을 수행 하 여 얻 어 진 Ct 값 을 검량 곡선 에 대입 함 으로써 해당 암모늄 산화 균 그룹 에 속하 는 개체 수 의 절대 값 을 신속 하 고 민감 하 게 정량 하 는 것 이 가능 함 을 확인 하 였 다 ( 도 6 내지 10 참조 ) . 상기 결과 를 통해 목적 하 는 암모늄 산화 균 그룹 을 정확 하 고 신속 하 게 정량 하 는데 본 발명 의 프라이머 및 프로브 셋 트 를 유용 하 게 이용 할 수 있 음 을 확인 하 였 다 .