상기 의 L 5 B 6 S 9 - A 바이러스 를 100 ml 의 부유 세포 배양액 에 0 . 01 MOI 로 접종 한 뒤 특정 배양 시간 동안 ( 즉 , 접종 후 8 시간 , 12 시간 , 16 시간 ) 바이러스 배양 을 실시 하 였 다 . 배 양물 에 BEI ( binary ethylenimine ) 를 넣 어 최종 농도 가 3 mM 이 되 도록 한 다음 , 진탕 배양기 ( shaking incubator ) 에서 37 ℃, 24 시간 동안 반응 시켰 다 ( 1 차 불 활화 단계 ) . 그런 다음 , 1 차 불 활화 단계 를 거친 바이러스 배양액 을 새 용기 로 옮겨 1 차 불 활화 단계 와 동일 한 농도 로 BEI 를 처리 하 고 26 ℃ 의 온도 에서 24 시간 동안 반응 시켰 다 ( 2 차 불 활화 단계 ) . 1 차 불 활화 단계 및 2 차 불 활화 단계 를 거친 바이러스 배양액 에 1 M 티오황산나트륨 ( sodium thiosulfate ) 의 농도 가 최종 1 %( 중량 %) 가 되 도록 투입 하 여 BEI 를 중화 시켜 불 활화 를 완료 하 였 다 . 바이러스 농축 및 정제 를 위하 여 7 . 5 % PEG 8000 과 혼합 하 여 4 ℃ 에서 밤새 교반 하 고 약 10 , 000 g 의 원심력 으로 약 30 분 동안 원심 한 뒤 Tris - NaCl [ pH 7 . 2 ] 버퍼 에 용해 시켰 다 . 상기 와 같이 불 활화 , 농축 및 정제 과정 을 거쳐 얻 은 항원 을 15 ~ 45 % 자당 구배 원심 분리 법 ( Sucrose gradient ultracentrification method ) 으로 4 ℃ 의 온도 에서 약 110 , 000 g 의 원심력 으로 약 180 분 동안 원심 분리 한 뒤 259 nm 의 파장 대 에서 분광 광도계 ( Spectrophotometer ) 로 정량 하 여 항원 획득 량 ( 146 S antigen 의 함량 ) 을 비교 하 였 다 . 항원 획득 량 은 측정 된 최종 항원 량 을 바이러스 배양액 기준 으로 계산 하 여 얻 어 내 었 다 ( 바이러스 배양액 1 ml 당 생산 된 항원 량 ㎍).