실험 종료 후 각 처리 군 의 마우스 를 희생 시켜 대뇌 피질 을 분리 하 고 완충액 ( 50 mM Tris - HCl pH 7 . 5 , 150 mM NaCl , 2 mM EDTA , 30 mM sodium pyrophosphate , 10 mM NaF , 2 mM Na 3 VO 4 및 protease inhibitor cocktail 함유 ) 을 넣 고 균질기 를 이용 하 여 균질 화 하 였 다 . 균질 액 을 12 , 000 rpm 에서 15 분 간 4 ℃ 에서 원심 분리 후 상층 액 만 을 얻 었 다 . 단백질 정량 은 bicinchoninic acid ( BCA , Pierce ) 법 을 사용 하 였 다 . 상층 액 은 4 × Lammlie 의 완충액 ( 62 . 5 mmol / ℓ Tris - HCl , pH 6 . 8 , 2 % SDS , 20 % glycerol 및 10 % 2 - mercaptoethanol 함유 ) 을 넣 고 95 ℃ 에서 끓였 다 . 정량 된 단백질 시료 50 μ g 을 4 - 12 % sodium dodecylsulfate - polyacrylamide gradient gel ( Invitrogen ) 을 이용 한 전기 영동 법 ( SDS - PAGE ) 으로 분리 하 였 고 , nitrocellulose paper ( Amersham ) 로 옮겼 다 . 단백질 이 옮겨진 막 을 Ponceau - S 로 염색 하 여 단백질 이 완전 하 게 옮겨졌 음 을 확인 하 고 , 0 . 1 % Tween 20 을 포함 하 는 Tris - buffered saline ( TBS - T ) 으로 씻 은 후 5 % 탈지 분 유액 으로 30 분 이상 블로킹 ( blocking ) 하 였 다 . 1 차 항체 Tau , 인산화 Tau ( p - Tau ) , A β 42 , β - actin 은 4 ℃ 에서 16 시간 동안 반응 시킨 후 막 을 TBS - T 에서 10 분 씩 3 회 세척 하 였 고 , blot 을 2 차 항체 와 함께 1 시간 동안 반응 시켰 다 . 2 차 항체 반응 후 막 을 씻 고 enhanced chemiluminiscence system ( ECL , Pierce ) 으로 원 하 는 단백질 을 가시 화 하 였 다 . 단백질 의 가시 화 및 정량 분석 은 image 장비 ( LAS - 3000 , Fuji ) 를 이용 하 였 다 .