도 5 . 포유동물 세포 에서 의 최적 화 된 SpCas 9 변이체 의 선택 . EGFP 를 안정 하 게 발현 하 는 293 세포 를 온 - 타 겟 sgRNA ( sgGFPon ) 또는 각각 의 미스 매칭 된 가이드 와 함께 가장 성능 이 양호 한 효모 - 단리 된 변이체 로부터 얻 어 진 돌연변이 의 계층 적 조합 에 의해 생성 된 단일 및 이중 ( a ) 뿐 만 아니 라 삼중 ( b ) 돌연변이체 로 형질 감염 시켰 다 . EGFP 형광 의 소실 을 형질 감염 후 7 일 에 FACS 분석 에 의해 측정 하 였 다 . ( c ) 가장 양호 하 게 생성 된 변이체 와 이전 에 공개 된 돌연변이체 의 병렬 비교 . 293 세포주 EGFP 넉 아웃 검정 을 사용 하 여 상부 단리 된 변이체 ( VNEL , VNEQ 및 VNES 변이체 ) 의 특이 성 을 평가 하 고 , 그 들 의 성능 을 이전 에 공개 된 고 - 충실 도 돌연변이체 와 비교 하 였 다 . EGFP 형광 의 소실 을 형질 감염 후 7 일 에 FACS 분석 에 의해 측정 하 였 다 . sgGFP 1314 는 스 페이서 서열 의 PAM 으로부터 위치 13 & 14 에 미스 매치 를 함유 하 고 ; sgGFP 1819 는 위치 18 & 19 에 미스 매치 를 함유 하 고 ; sgGFP 18 은 위치 18 에 단일 미스 매치 를 함유 한다 . 점선 은 나타내 어 진 온 / 오프 커플 에 대해 계산 된 온 / 오프 타 겟 비 를 나타낸다 . 파선 은 EGFP 형광 의 배경 소실 을 나타낸다 . 오 차 막대 는 n ≥ 2 에 대한 s . e . m . 을 나타낸다 .