ELISA 플레이트 ( 코스타 ) 를 BupH 카르보 네이트 - 비 카르보 네이트 완충제 , pH 9 . 4 ( 써 모 피셔 사이언 티 픽 ) 중 에 희석 된 100 μ l 의 각각 의 포획 항체 로 4 ℃ 에서 밤새 코팅 하 였 다 . 포획 항체 MJFR 1 ( 압 캠 ) 을 0 . 1 μ g / ml ( 총 α - 시뉴 클레인 검정 ) 또는 0 . 35 μ g / ml ( pS 129 검정 ) 의 농도 로 사용 하 고 , MJFR 14642 ( 압 캠 ) 는 0 . 1 μ g / ml 및 1 E 8 은 0 . 3 μ g / ml 의 농도 로 사용 하 였 다 . 플레이트 를 둘 베코 PBS ( 써 모 피셔 사이언 티 픽 ) 로 4 - 회 세척 하 고 , PBS 중 의 3 % BSA ( 소 혈청 알부민 , 프로테아제 무 함유 , 분획 V ) 로 2 ~ 3 시간 동안 RT 에서 또는 4 ℃ 에서 밤새 차단 하 였 다 . 표준물 , 뇌 샘플 및 QC 샘플 을 로슈 컴 플리트 프로테아제 억제제 ( 1 펠릿 / 25 ml ) 및 포스 파타 제 억제제 2 & 3 ( 시그마 알드리치 , 1 : 100 ) 을 함유 하 는 1 % BSA / 0 . 05 % 트윈 / PBS 로 희석 하 였 다 . 표준물 은 α - 시뉴 클레인 WT ( 알 펩티드 ) , pS 129 ( aa 89 - 140 , A A T G F V K K D Q L G K N EEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP - pS - EEGYQDYEPEAHHHHHH - CONH 2 ; 서열 식별 번호 : 129 ) 또는 PFF 였 다 . PFF 및 단량체 의 초음파 처리 는 콘 테스 마이크 로 초음파 세포 교란 기 ( 출력 40 , 튠 50 ) 를 사용 하 여 수행 하 였 다 . 샘플 을 1 초 / 펄스 로 15 - 회 초음파 처리 하 였 다 . 샘플 50 μ L / 웰 을 이중 으로 로딩 하 고 , 4 ℃ 에서 O / N 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 RT 로 평형 화 한 후 , 1 % BSA / 0 . 1 % 트윈 / DPBS 중 에 1 : 4000 으로 희석 된 50 μ l 검출 항체 를 첨가 하 고 , 샘플 과 RT 에서 ~ 2 시간 동안 공동 - 인 큐 베이 션 하 였 다 . 검출 항체 ( 코 반스 ( Covance ) 로부터 의 4 B 12 , 압 캠 으로부터 의 MBJR 13 , 2 E 2 , 및 23 H 8 ) 를 알칼리 성 포스 파 타제 ( 노부스 바이올로지 칼스 로부터 의 AP 키트 ) 와 사전 - 접합 시켰 다 . 이어서 플레이트 를 0 . 05 % 트윈 / PBS 로 4 - 회 세척 하 고 , 100 μ L 의 알칼리 성 포스 파타 제 기질 ( 트 로 픽스 CDP 스타 레디 - 투 - 유즈 위드 사파이어 II , T - 2214 , 써 모 피셔 사이언 티 픽 ) 로 30 분 동안 발색 시켰 다 . 발광 계수 를 퍼킨 엘머 엔 비전 ( 2102 멀티 라벨 리더 ) 으로 측정 하 였 다 . 플레이트 를 검정 동안 일정 한 진탕 ( 적정 플레이트 진탕기 , 속도 3 ) 하 에 유지 시켰 다 . 데이터 를 그래프 패드 프리즘 ( GraphPad Prism ) 을 사용 하 여 분석 하 였 다 .