3 차 신경 뉴론 에 다양 한 투 여량 의 항 - NGF 항체 Mab 911 ( Fab ) , 8 L 2 - 6 D 5 ; H 19 - L 129 ; E 3 및 3 C ; 및 0 . 4 ng / ml ( 약 15 pM ; 이 농도 는 생존 을 위한 NGF 의 포화 농도 를 나타낸다 ) 및 0 . 04 ng / ml ( 약 1 . 5 pM ; 이 농도 는 IC 50 부근 의 값 이 다 ) 의 농도 의 인간 또는 래트 NGF 를 첨가 함 으로써 항 - NGF Fab 또는 항체 의 차단 활성 을 평가 하 였 다 . 배양액 에서 48 시간 후 , 세포 를 다음 과 같 은 바이오 멕 ( Biomek ) FX 액체 취급 워크스테이션 ( 베크만 쿨터 ( Beckman Coulter ) ) 상 에서 수행 되 는 자동 화 된 면역 세포 화학 프로토콜 에 가하 였 다 : 4 % 포름알데하이드 , 5 % 슈 크로스 및 PBS 를 이용 한 고정 ; PBS 중 의 0 . 3 % 트리톤 X - 100 을 이용 한 투과 ; 5 % 정상 염소 혈청 , PBS 중 의 0 . 11 % BSA 를 이용 한 비 특이 적 결합 부위 의 차단 ; 및 뉴론 을 검출 하 기 위한 1 차 및 2 차 항체 와 의 순차 적 항온 처리 . 1 차 항체 는 단백질 유전자 생성물 89 . 5 에 대한 토끼 폴리 클론 항체 ( PGP 9 . 5 , 케미 콘 ( Chemicon ) ) 이 고 , 이 는 확립 된 뉴론 표현 형 마커 이 다 . 2 차 항체 는 배양액 에 존재 하 는 모든 세포 의 핵 을 라벨 링 하 기 위한 핵 염료 훽 스 트 ( Hoechst ) 33342 ( 몰레 큘라 프로브 스 ( Molecular Probes ) ) 와 함께 알렉사 플루오르 ( Alexa Fluor ) 488 염소 항 - 토끼 ( 몰레 큘라 프로브 스 ) 이 었 다 . 이미지 포착 및 이미지 분석 은 디스커버리 - I / GenII 이미 저 ( Imager ) ( 유니 버 샬 이매 징 코 포레이 션 ( Universal Imaging Corporation ) ) 상 에서 수행 되 었 다 . 이미지 는 알렉사 플루오르 488 및 훽 스 트 33342 에 대한 2 개 의 파장 에서 자동 으로 포획 되 었 고 , 핵 염색 이 모든 웰 에 존재 하 기 때문 에 핵 염색 은 이미 저 의 이미지 에 근거 한 자동 초점 시스템 에 대한 기준점 으로 이용 되 었 다 . 각각 의 웰 의 전체 표면 을 커버 하 도록 적절 한 대상 및 웰 당 지점 의 수 가 선택 되 었 다 . 항 - PGP 9 . 5 항체 를 이용 한 이 들 의 특이 적 염색 에 근거 하 여 배양액 에서 48 시간 후 에 각각 의 웰 에 존재 하 는 뉴론 의 수 를 계수 하 도록 자동 화 된 영상 분석 을 설정 하 였 다 . 이미지 의 조심 스러운 문턱 값 및 형태 및 형광 강도 에 근거 한 선택 성 필터 의 적용 으로 인해 웰 당 뉴론 의 정확 한 수 가 생성 된다 .