온 - 타 겟 부위 에 대한 활성 과 함께 , evoCas 9 특이 성 을 2 개 의 로커스 에서 에디 팅 과 연관 된 2 개 의 이전 에 검증 된 오프 - 타 겟 부위 에서 의 에디 팅 속도 를 확인 함 으로써 측정 하 였 다 : FANCF 부위 2 및 CCR 5 sp 11 . 이 들 로커스 의 Cas 9 에디 팅 은 흥미 로운데 , 이 는 FANCF 부위 2 - 연관 된 오프 - 타 겟 이 SpCas 9 - HF 1 이 특이 적 온 - 타 겟 부위 로부터 식별 할 수 없 었 던 소수 의 비 - 반복 적 부위 중 하나 였 던 반면 , AIDS 치료 에서 그 의 치료 적용 에 대한 가치 를 갖 는 CCR 5 sp 11 로커스 는 매우 상동성 CCR 2 유전자 의 오프 - 타 겟 절단 과 상관 되 기 때문 이 다 . 293 T 세포 에서 의 일시 적 형질 감염 후 , 이 들 2 개 의 오프 - 타 겟 로커스 에서 의 indel 형성 을 TIDE 를 사용 하 여 측정 하 였으며 , 이 는 야생 형 SpCas 9 - 형질 감염 된 세포 와 비교 할 경우 에 evoCas 9 를 발현 하 는 세포 에서 의 절단 의 유의 한 감소 를 밝혀 내 었 다 ( 도 8 a ) . 또한 , 야생 형 SpCas 9 , evoCas 9 및 SpCas 9 - HF 1 에 대한 온 / 오프 - 타 겟 비 의 계산 은 본 발명 의 변이체 가 이 들 2 개 의 로커스 에서 그 의 경쟁자 들 을 능가 할 수 있 었 음 을 확인 시켜 주 었 다 ( 도 8 b ) . CCR 5 sp 11 로커스 및 CCR 2 유전자 에서 의 그 의 오프 - 타 겟 의 협조 절단 은 대략 16 킬로 베이스 의 염색체 결실 을 생성 한다 ( 도 8 c 에 도식 화 됨 ) . 이러 한 염색체 재배열 의 빈도 를 CCR 5 로커스 를 타 겟 팅 하 는 sgRNA 와 함께 야생 형 SpCas 9 , evoCas 9 또는 SpCas 9 - HF 1 로 형질 감염 된 세포 에서 반 - 정량 적 PCR 에 의해 측정 하 였 다 . 전위 이벤트 는 야생 형 SpCas 9 에 의해 에디 팅 된 세포 에서 특히 명백 했 던 반면 , 간신히 검출 가능 한 수준 으로 의 결실 의 양 의 강한 감소 가 SpCas 9 - HF 1 및 evoCas 9 의 존재 하 에서 둘 다 관찰 되 었 으며 , 후자 는 전자 에 비해 거의 2 배 만큼 측정 된 결실 을 더 감소 시켰 다 ( 도 8 c ) .