MG 1655 GI 1 . 5 - pgl : : CMP 의 염색체 DNA 를 주형 으로 사용 하 여 FRT - CMP - FRT - GI 1 . 5 - ybhE 구성 물 을 함유 하 는 PCR 절편 을 생성 하 였 다 . 이러 한 구성 물 은 하 기 와 같이 pBBR 1 MCS 5 ( 겐타마이신 ) 으로 클로닝 되 었 다 . 본원 에서 CMP - GI 1 . 5 - pgl 로 지칭 되 는 절편 을 , 5 ' 프라이머 Pglconfirm - F 및 3 ' 프라이머 3 ' EcoRV - pglstop 을 사용 하 여 증폭 시켰 다 . 제 조사 가 제시 한 바 와 같이 , Invitrogen TOPO - Blunt 클로닝 키트 를 사용 하 여 플라스미드 벡터 pCR - Blunt II - TOPO 내 로 생성 된 절편 을 클로닝 하 였 다 . CMP - GI 1 . 5 - pgl 절편 을 갖 는 NsiI 절편 을 pBBR 1 MCS 5 ( 겐타마이신 ) 의 PstI 위치 로 클로닝 하 였 다 . 5 ㎕ CMP - GI 1 . 5 - pgl 삽 입물 , 2 ㎕ pBBR 1 MCS 5 ( 겐타마이신 ) 벡터 , 1 ㎕ T 4 DNA 리가아제 ( New England Biolabs ) , 2 ㎕ 1 OX 리가아제 완충액 , 및 lO ㎕ ddH 2 O 를 함유 하 는 20 ㎕ 라 이게 이 션 반응물 을 제조 하 였 다 . 라 이게 이 션 혼합물 을 실온 에서 40 분 동안 인 큐 베이 션 한 후 , 상기 개시 된 매개변수 를 사용 하 여 전기 수용성 Top 10 세포 ( Invitrogen ) 내 로 2 ~ 4 uL 를 전기 천공 하 였 다 . 10 ug / ㎖ 클로람페니콜 및 5 ug / ㎖ 겐타마이신 을 함유 하 는 L 한 천 상 에서 형질전환 체 를 선별 하 였 다 . 선별 된 클론 의 서열 을 상기 기재 된 다수 의 프라이머 뿐 만 아니 라 Sequetech , CA 에 의해 제공 되 는 역방향 프라이머 및 사내 ( in - house ) T 3 을 사용 하 여 측정 하 였 다 . 이러 한 플라스미드 를 pBBRCMPGI 1 . 5 - pgl 로 지정 하 였 다 ( 도 77 A ~ B 및 SEQ ID NO : 122 ) .