Y . 리포 리티 카 코돈 - 최적 화 된 쿠 주 이소프렌 신 타아 제 유전자 를 인코딩 하 는 단일 pENTR / D - TOPO 플라스미드 를 , 주문 제작 된 pTrex 3 g 벡터 에 게이트웨이 클로닝 ( Gateway Cloning ) 하 는 데 사용 하 였 다 . pTrex 3 g 의 구성 은 WO 2005 / 001036 A 2 에 기재 되 어 있 다 . 게이트웨이 LR 클로 나 아제 ( Clonase ) II 효소 믹스 키트 ( Invitrogen ) 에 대한 제조사 의 프로토콜 에 따라 반응 을 수행 하 였 다 : 1 ㎕ Y . 리포 리티 카 코돈 - 최적 화 된 쿠 주 이소프렌 신 타아 제 유전자 pENTR / D - TOPO 공 여자 벡터 , 1 ㎕ pTrex 3 g 목적지 벡터 , 6 ㎕ TE 완충액 , pH 8 . 0 ( 총 반응 부피 8 ㎕). 반응물 을 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 한 후 , 1 ㎕ 프로테 이나 아제 K 용액 을 첨가 하 고 37 ℃ 에서 10 분 동안 인 큐 베이 션 을 지속 하 였 다 . 이후 1 ㎕ 의 반응물 을 TOP 10 화학 적 수용성 대장균 세포 에 형질 전환 시켰 다 . 형질전환 체 를 LA 및 50 ㎍/㎖ 카르 베 니 실린 플레이트 상 에서 선별 하 였 다 . 여러 콜로니 를 고르 고 , 각각 을 LB 및 50 ㎕ g / ㎖ 카르 베니 실린 을 함유 하 는 5 ㎖ 튜브 에 접종 하 고 배 양물 을 200 rpm 에서 진탕 하 면서 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 성장 시켰 다 . 제 조사 의 프로토콜 에 따라 , QIAprep Spin Miniprep 키트 ( Qiagen , Inc . ) 를 사용 하 여 하룻밤 배양 튜브 에서 플라스미드 를 단리 하 였 다 . 여러 플라스미드 를 서열 분석 하 여 DNA 서열 이 올바른지 확인 하 였 다 .