본 출원 에 기재 된 물질 의 AHR 억제 활성 을 평가 하 기 위해 , 리간드 - 유도 된 AHR 유전자 조절 을 용량 - 의존 성 방식 으로 길항 하 는 그 의 능력 을 정량 화 하 였 다 . 이 목적 을 위해 , 정량 적 PCR 분석 을 사용 하 여 , AHR 억제제 존재 및 부재 하 에 200 uM KA 에 의한 자극 시 인간 단핵구성 U 937 세포주 에서 AHR - 조절 된 유전자 CYP 1 A 1 의 발현 을 결정 하 였 다 . U 937 세포 를 96 - 웰 마이크 로타 이터 플레이트 에서 성장 배지 ( RPMI 1640 , 20 % FCS ) 100 ul 중 에 2 x 105 세포 / 웰 의 농도 로 시 딩 하 였 다 . CYP 1 A 1 발현 을 물질 의 존재 또는 부재 하 에 200 uM KA ( 양성 대 조군 ) 에 의해 6 시간 동안 유도 하 였 다 . 인간 U 937 세포 를 전형 적 으로 8 개 의 상이 한 농도 의 물질 ( 1 nM , 3 nM , 10 nM , 30 nM , 100 nM , 300 nM , 1 uM 및 3 uM ) 과 함께 인 큐 베이 션 하 고 , 동일 한 마이크 로 타이 터 플레이트 에서 이중 으로 분석 하 였 다 . 자극 후 에 , 세포 를 핵산 용해 용액 ( # 4305895 , 어 플 라이드 바이오 시스템즈 ( Applied Biosystems ) ) 에 용해 시키 고 , RNA 를 6100 핵산 제조 스테이션 ( 어 플 라이드 바이오 시스템즈 ) 를 사용 하 여 단리 하 고 , 슈퍼 스크립트 VILO cDNA 합성 키트 ( # 11754 - 250 , 인 비트 로 젠 ( Invitrogen ) ) 를 사용 하 여 cDNA 로 역전사 하 였 다 . 자극 되 지 않 은 세포 를 음성 대 조군 으로 사용 하 였 다 . 인간 CYP 1 A 1 ( Hs 01054797 _ g 1 ) 및 인간 HPRT ( Hs 02800695 _ m 1 ) 을 위한 택 맨 프로브 를 HPRT 의 CYP 1 A 1 의 폴드 발현 을 분석 하 는 데 사용 하 였 다 . 정량화 를 택 맨 SDS 7900 HT 에서 수행 하 였 다 .