관심 대상 단백질 내 의 특정 부위 에 및 / 또는 특정 배향 으로 클릭 핸들 을 도입 하 는 것 이 바람직 할 수 있 다 . 관심 대상 단백질 은 , 커플링 시약 을 사용 한 표지 화 에 의해 적혈구 세포 로 의 커플링 을 위해 준비 되 었 다 . 한 가지 방법 에서 , 이 황화물 결합 의 브리 징 을 통한 부위 특이 적 클릭 핸들 컨 쥬게 이 션 을 위해 티오 링커 화학 을 재조합 항 - CTLA 4 Fab 단백질 에 도입 하 였 다 . Fab 을 탈염 시키 고 , 완충액 을 PBS 로 교환 하 고 , 표지 화 전 에 1 mg / mL 이상 으로 농축 시켰 다 . 이어서 , Fab 를 5 mM DTT 로 환원 시키 고 , 37 ℃ 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 고 , 이어서 완충액 을 PBS 로 교환 하 였 다 . 환원 된 이 황화물 결합 을 표지 하 기 위해 티오 링커 커플링 시약 을 단백질 농도 에 비해 15 배 몰 과량 으로 첨가 하 였 다 . 단백질 표지 화 반응 을 4 ℃ 에서 16 내지 18 시간 동안 인 큐 베이 션 하 고 , Zeba 컬럼 을 사용 하 여 탈염 시켰 다 . 표지 화 수준 을 검출 하 기 위해 , 나노 드롭 UV - Vis 프로그램 을 이용 하 여 750 nm 에서 의 기준선 보정 과 함께 흡광 도 280 nm 및 309 nm 에서 대략 1 내지 3 μ L 의 표지 된 단백질 을 판독 하 였 다 . 표지 화도 는 단백질 당 8 . 3 개 의 DBCO 클릭 핸들 분자 였 다 . 항 - CTLA - 4 Fab 상 에서 의 티오 링커 배향 된 클릭 핸들 표지 화 를 다른 클릭 핸들 시약 과 비교 하 였 고 , 이 는 세포 의 실질 적 인 표지 화 를 유발 하 는 것 으로 밝혀졌 다 . 티오 링커 - 표지 항 - CTLA - 4 는 재조합 CTLA 4 로 의 기능 적 결합 을 유의 하 게 증가 시키 는 것 으로 또한 밝혀졌 다 .