분비 된 His 6 - 태 깅된 재조합 트립 타제 ( 야생 형 또는 돌연변이체 ) 를 함유 하 는 CHO 세포 배지 또는 곤충 세포 배지 는 170 cm / 시간 의 용적 측정 유량 으로 10 mL Ni - NTA Superflow 칼럼 ( Qiagen ) 상 에 장입 되 었 다 . 칼럼 은 10 CV ( 칼럼 용적 ) 의 세정 완충액 ( 20 mM Tris pH 8 , 10 mM 이미다졸 , 300 mM NaCl ) 로 세정 되 었 고 8 CV 용출 완충액 ( 20 mM Tris pH 8 , 300 mM 이미다졸 , 300 mM NaCl ) 로 용출 되 었 다 . 트립 타제 를 함유 하 는 나트륨 도데 실 설 페이트 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 ( SDS - PAGE ) 에 의해 검정 된 분획 은 풀 링 되 었 고 , 농축 되 었 고 , 그리고 제조자 에 의해 권고 된 유량 으로 작동 완충액 ( 10 mM 3 -( N - 모 폴리노 ) 프로판 설폰산 ( MOPS ) pH 6 . 8 , 2 M NaCl ) 을 이용 하 여 S 200 크기 배제 칼럼 ( GE Healthcare ) 상 에 장입 되 었 다 . His - 태 깅된 재조합 트립 타제 ( 단량체 성 ) 을 함유 하 는 분획 은 풀 링 및 농축 되 었 다 . 재조합 트립 타제 는 그 다음 0 . 5 mg / ml 헤파린 ( Sigma Aldrich ) 및 0 . 1 mg / ml 엔 테 로 키나제 ( New England Biolabs , Inc ) 를 함유 하 는 완충액 ( 10 mM MOPS pH 6 . 8 , 0 . 2 M NaCl ) 내 2 mg / ml 의 농도 로 실온 에서 밤새 절단 되 었 다 . 이 단계 는 N - 말단 His 6 - 태그 를 제거 하 고 사량 체화 및 단백질 분해 적 으로 활성 트립 타제 를 초래 하 고 , 이 는 잔기 16 ( 키모트립시노겐 넘버링 ) 에서 시작 하 는 새로 형성 된 N - 말단 서열 로서 IVGG 를 갖 는다 . 사량 체 트립 타제 는 그 다음 엔 테 로 키나제 및 임의 의 비 절단 된 재조합 트립 타제 제거 에 의해 사량 체 트립 타제 를 정제 하 기 위해 완충액 ( 10 mM MOPS pH 6 . 8 및 2 M NaCl ) 내 S 200 칼럼 ( GE Healthcare ) 를 사용 하 는 크기 배제 크로마토그래피 를 거치 게 되 었 다 .