간략 하 게 는 , FACS 튜브 당 5 x 10 E 5 I 24 세포 를 총 정제 된 항체 믹스 와 함께 인 큐 베이 션 하 고 , 1 시간 동안 빙상 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 ( 적정 160 ㎍/ ml 믹스 ) . 각각 의 정제 된 항체 야생 형 < IGF - 1 R > 및 < ANGPT 2 > 를 대 조군 으로서 I 24 세포 에 적용 하 였 다 . 4 ml 빙 냉 PBS ( Gibco ) + 2 % FCS ( Gibco ) 로 세척 하 여 미 결합 된 항체 를 제거 하 고 , 세포 를 원심 분리 하 고 ( 400 g 에서 5 분 ) , 결합 된 이중 특이 적 항체 를 2 ㎍/ mL 인간 ANGPT 2 ( R & D Systems ) 50 ㎕ 로 1 시간 동안 빙상 에서 검출 하 였 다 . 이후 , 미 결합 된 ANGPT 2 를 4 ml 빙 냉 PBS ( Gibco ) + 2 % FCS ( Gibco ) 로 1 회 세척 하 여 제거 하 고 , 세포 를 원심 분리 하 고 ( 400 g 에서 5 분 ) , 결합 된 ANGPT 2 를 5 ㎍/ mL < ANGPT 2 > mIgG 1 - 바이오틴 항체 ( BAM 0981 , R & D Systems ) 50 ㎕ 로 45 분 동안 빙상 에서 검출 하 고 ; 대안 적 으로 는 , 세포 를 5 ㎍/ mL mIgG 1 - 바이오틴 - 이 소형 대 조군 ( R & D Systems ) 50 ㎕ 과 함께 인 큐 베이 션 하 였 다 . 4 ml 빙 냉 PBS ( Gibco ) + 2 % FCS ( Gibco ) 로 세척 하 여 미 결합 된 검출 항체 를 제거 하 고 , 세포 를 원심 분리 하 고 ( 400 g 에서 5 분 ) , 결합 된 검출 항체 를 50 ㎕ 1 : 400 스 트 렙 타비 딘 - PE 접합체 ( Invitrogen / Zymed ) 로 , 차광 하 여 45 분 동안 빙상 에서 검출 하 였 다 . 4 ml 빙 냉 PBS + 2 % FCS 로 세척 하 여 미 결합 된 스 트 렙 타비 딘 - PE 접합체 를 제거 하 였 다 . 이후 , 세포 를 원심 분리 하 고 ( 400 g 에서 5 분 ) , PBS 300 ~ 500 ㎕ 에 재현 탁 시키 고 , 결합 된 스 트 렙 타비 딘 - PE 접합체 를 FACSCalibur 또는 FACS Canto ( BD ( FL 2 채널 , 획득 량 당 10 , 000 세포 ) 상 에서 정량 화 하 였 다 . 상기 실험 동안 각각 의 이 소형 대 조군 을 포함 시켜 , 임 의 비 특이 적 결합 사건 을 제외 시켰 다 . 또한 , 정제 된 단일 특이 적 , 2 가 IgG 1 항체 < IGF - 1 R > 및 < ANGPT 2 > 를 대 조군 으로서 포함 시켰 다 .