서열 번호 2813 변이체 를 발현 하 는 맑 아 진 이 . 콜라 이 배양 용 해물 의 96 웰 플레이트 에서 검정 을 수행 하 였 다 . 용해 완충제 부피 는 400 μ L 이 었 고 , 용해 물 은 20 배 희석 되 었 다 . 이전 라운드 로부터 의 유익 한 돌연변이 가 재조합 된 라이브러리 의 스크리닝 을 위해 , 검정 은 100 μ L 반응 부피 에서 10 μ L 의 희석 된 용해 물 및 0 . 4 g / L SUS SFP 서열 번호 1456 을 사용 하 고 7 . 5 mM 레바 우디 오시드 A 의 기질 로딩 및 0 . 4 mM ADP ( Sigma , > 95 %) 및 30 mM 수크로스 ( Sigma ) 의 보조 기질 로딩 을 사용 하 여 수행 하 였 다 . 하 기 반응 조건 을 사용 하 였 다 : 1 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 6 . 5 , 50 ℃. 반응물 은 물 에 1 : 20 으로 희석 한 후 , 20 μ L 의 희석 된 검정 물 을 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 80 μ L 아세 토니 트릴 에 첨가 함 으로써 켄 칭 하 였 다 . 생 성 혼합물 을 4 ℃ 에서 10 분 동안 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 상청 액 을 물 에 1 : 10 으로 희석 하 고 , RapidFire SPE - MS / MS 에 의해 분석 하 였 다 . 레바 우디 오시드 A 에 대한 SuS 와 연결 된 글 루 코 실트 랜스 퍼라 제 활성 을 갖 는 생성 된 조작 된 변이체 가 표 47 . 1 에 열거 되 어 있 다 . 라운드 8 포화 돌연변이 유발 라이브러리 에 대해 , 스크리닝 은 상기 설명 한 바 와 같이 수행 하 되 , 0 . 2 g / L SUS SFP 서열 번호 1582 , 0 . 2 mM ADP 를 사용 하 고 , 다음 과 같 은 반응 조건 을 사용 하 였 다 : 2 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 6 , 55 ℃. 상기 라이브러리 로부터 의 상위 56 개 의 변이체 는 동일 한 검정 조건 을 사용 하 여 삼중 으로 재 시험 하 되 , 0 . 15 g / L SUS SFP 서열 번호 1582 를 사용 하 였 다 . 생성 된 조작 된 GT 변이체 폴리펩티드 는 표 47 . 2 에 열거 되 어 있 다 . 표 47 . 3 에 열거 된 변이체 에 대해 진탕 플라스크 규모 배 양물 을 성장 시키 고 , 용해 시키 고 , 분말 로 동결 건조 시켰 다 .