세포 배양 상청 액 중 의 항체 및 유도체 의 농도 를 단백질 A 아가로오스 - 비 이드 ( Protein A Agarose - bead ) ( Roche ) 로 의 면역 침전 에 의해 추정 하 였 다 . 60 ㎕ 단백질 A 아가로오스 비 이드 를 TBS - NP 40 ( 50 mM Tris , pH 7 . 5 , 150 mM NaCl , 1 % Nonidet - P 40 ) 로 3 회 세정 하 였 다 . 이어서 , 1 ~ 15 mL 세포 배양 상청 액 을 TBS - NP 40 로 미리 평형 화 된 단백질 A 아가로오스 비 이드 에 적용 하 였 다 . 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 후 , 비 이드 를 Ultrafree - MC - 필터 컬럼 ( Amicon ) 에서 0 . 5 mL TBS - NP 40 으로 1 회 , 0 . 5 mL 2 x 인산염 완충 식염수 ( 2 xPBS , Roche ) 로 2 회 , 0 . 5 mL 100 mM Na - 시트 레이트 pH 5 . 0 으로 간략 하 게 4 회 세정 하 였 다 . 35 ㎕ NuPAGE ? LDS 샘플 완충액 ( Invitrogen ) 를 첨가 하 여 결합 된 항체 를 용리 하 였 다 . 샘플 절반 을 NuPAGE ? 샘플 환원제 와 조합 시키 거나 비 환원 된 채 로 두 고 , 각각 70 ℃ 에서 10 분 동안 가열 하 였 다 . 그 결과 , 5 ~ 30 ㎕ 을 4 ~ 12 % NuPAGE ? Bis - Tris SDS - PAGE ( Invitrogen ) ( 비 환원 된 SDS - PAGE 의 경우 MOPS 를 사용 , 및 환원 된 SDS - PAGE 의 경우 NuPAGE ? 항산화제 러닝 완충액 첨가제 ( Invitrogen ) 가 함유 된 MES 완충액 을 사용 ) 에 적용 하 고 , 코마 시 블루 ( Coomassie Blue ) 로 염색 하 였 다 .