상기 하이브리도마 세포 에 의해 분비 된 항체 들 이 IgG 또는 IgM 아이 소타 입 중 어느 것 인지 결정 하 기 위해 , ELISA 검정 법 을 이용 하 였 다 . 4 ℃ 의 코팅 완충액 ( coating buffer ) ( 0 . 1 M 탄산염 / 중탄산염 완충액 , pH 9 . 2 - 9 . 6 ) 중 의 2 . 4 마이크로그램 / mL 농도 의 염소 항 - 마우스 IgG + IgM ( H + L ) 를 100 마이크 로 리터 / 웰 로 ELISA 플레이트 들 에 첨가 하 여 하룻밤 두 었 다 . 상기 플레이트 들 을 세척 완충액 ( PBS + 0 . 05 % Tween ) 중 에서 3 회 세척 하 였 다 . 상기 플레이트 에 100 마이크 로 리터 / 웰 의 차단 완충액 ( 세척 완충액 중 5 % 우유 ) 을 첨가 하 여 실온 에서 1 시간 동안 둔 후 , 세 척 완충액 중 에서 3 회 세척 하 였 다 . 100 마이크 로 리터 / 웰 의 하이브리도마 상청 액 을 첨가 하 고 , 플레이트 들 을 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 들 을 세척 완충액 으로 3 회 세척 하 고 , 염소 항 - 마우스 IgG 또는 IgM 양 고추냉이 과산화 효소 접합체 의 1 / 100 , 000 희 석물 ( 5 % 우유 를 함유 한 PBS 중 에 희석 시킨 것 ) 을 , 100 마이크 로 리터 / 웰 로 첨가 하 였 다 . 플레이트 들 을 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 한 후 , 세 척 완충액 으로 3 회 세척 하 였 다 . TMB 용액 100 마이크 로 리터 / 웰 을 실온 에서 1 - 3 분 간 인 큐 베이 션 하 였 다 . 50 마이크 로 리터 / 웰 의 2 M H 2 SO 4 를 첨가 하 여 색 반응 을 종결 시키 고 , 플레이트 들 을 Perkin - Elmer HTS 7000 플레이트 판독기 로 450 nm 에서 판독 하 였 다 . 도 1 에 나타난 바 와 같이 , AR 51 A 630 . 3 하이브리도마 는 주로 IgG 아이 소타 입 의 항체 들 을 분비 하 였 다 .