먼저 , 상기 실시 예 2 - 1 의 고체 발효 물 3 g 에 , 염화 나트륨 이 첨가 된 구연 산염 버퍼 ( citric acid buffer ) 30 ㎖ 를 가해 상온 에서 1 시간 동안 추출 하 였 다 . 이후 , 상기 추출 된 추 출액 을 4000 rpm , 20 분 간 원심 분리 하 여 상등 액 을 0 . 45 ㎛ 시린지 필터 ( syringe filter ) 로 여과 하 여 아스 퍼질 러스 오 리재 Enz - 5 조효소 추출 액 을 얻 었 다 . . 상기 얻 어 진 아스 퍼질 러스 오 리재 Enz - 5 조효 소액 을 희석 하 였 다 . 이때 , 효소 의 활성 이 알려 지 지 않 았 을 경우 에 는 희석 액 별로 적절히 반응 시켜 티로신 ( tyrosin ) 기준 범위 에 포함 되 는 희석 배수 를 선택 하 였 다 . 이후 , 상기 조효 소액 0 . 5 ㎖ 및 맥 클 베인 버퍼 ( McIlvaine buffer ) ( pH 6 . 0 ) 1 ㎖ 를 글 래스 테스트 튜브 에 넣 고 40 ℃ 에서 5 분 간 예열 하 였 다 . 이때 , 기질 용액 을 또 다른 테스트 튜브 에 넣 고 40 ℃ 에서 5 분 간 예열 하 였 다 . 이후 , 상기 예열 된 조효 소액 에 기질 용액 1 . 5 ㎖ 을 일정 시간 간격 으로 ( 10 초 혹은 20 초 간격 ) 넣 고 즉시 혼합 하 였 다 . 상기 조효 소액 및 기질 용액 혼합물 을 40 ℃ ± 0 . 5 에서 60 분 동안 반응 시킨 후 정확히 반응 60 분 이 되 는 시점 에서 반응 정지액 ( 0 . 4 M TCA 용액 , 트리클로로아세트산 ( Trichloroacetic acid ) ) 3 ㎖ 를 첨가 하 여 반응 을 정지 시켰 다 . 상기 혼합물 의 최종 부피 는 5 ㎖ 가 되 었 으며 반응 정지액 을 첨가 한 직후 하얀색 의 침전 이 발생 하 는 것 을 확인 할 수 있 었 다 . 반응 이 종료 된 용액 은 와트만지 ( Watman paper ) # 2 를 이용 하 여 여과 하 고 여과 액 1 ㎖ 를 테스트 튜브 에 옮겼 다 . 이후 , 상기 여과 액 1 ㎖, 0 . 4 M 탄산 나트륨 용액 5 ㎖ 및 페놀 시약 1 ㎖ 를 순서 로 첨가 하 여 혼합 하 고 40 ℃ 에서 30 분 간 반응 시킨 후 흡광도 계 660 ㎚ 에서 발색 반응 을 확인 하 였 다 .