96 - 웰 플레이트 ( Corning , NY 14831 , USA ) 에 BSA 또는 KLH 를 Tris - HCl 완충 용액 ( pH 9 . 5 ) 에 100 μ g / ml 농도 로 녹인 다음 , 각 웰 당 5 μ g / 50 μ l 가 되 도록 가하 였 다 . 상온 에서 2 시간 을 방치 한 후 3 % 탈지유 ( skim milk ) 용액 을 각 웰 당 200 μ l 씩 넣 어서 하룻밤 동안 블로킹 ( blocking ) 하 였 다 . 이어서 3 차 , 4 차 및 5 차 항원 주사 후 얻 은 항혈청 들 을 각각 PBS ( phosphate buffer saline ) 에 250 배 , 500 배 , 1000 배 , 2000 배 씩 희석 하 여 각 웰 당 50 μ l 씩 분주 하 였 다 . 상온 에서 2 시간 방치 한 다음 PBS 로 세척 하 고 알 칼린 포스 파타 제 - 결합 된 토끼 항 - 쥐 ( alkaline phosphatase - conjugated rabbit anti - mouse ) IgG 항체 를 각 웰 당 50 μ l 씩 분주 하 였 다 . 이 를 상온 에서 90 분 동안 방치 한 다음 PBS 로 세척 하 였으며 , 0 . 5 mM MgCl 2 및 p - 니트 로 페닐 인산염 ( p - nitrophenyl phosphate ) 을 함유 한 Tris - HCl 완충 용액 ( 50 mM , pH 9 . 5 ) 과 반응 시키 고 각 웰 의 발색 정도 는 ELISER 판독기 ( reader ) 를 사용 하 여 405 nm 에서 측정 했 다 .