미성숙 휴먼 DC 를 소 변형 으로 앞서 기재 된 바 와 같이 ( Sallusto and Lanzavecchia , 1994 ) 휴먼 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMCs ) 로 부 터 생성 하 였 다 . 간략히 , PBMCs 는 Ficoll 구배 ( Amersham Biosciences ) 에 걸친 밀도 - 구배 원심 분리 를 이용 하 여 건강 한 지원자 의 헤파린 처리 된 혈액 으로부터 분리 되 었 다 . 회수 된 PBMC 분획 은 10 % 열 - 불 활성 화 된 FCS ( fetal calf serum ) 이 보충 된 RPMI 1640 배지 ( Bodinco BV ) 에서 3 회 세척 되 었 다 . 그 다음 , 3 층 Percoll 구배 ( GE Healthcare Bio - Sciences AB ) ( RPMI 1640 ( 10 % FCS ) 내 에 용해 된 60 %, 47 . 5 % 및 34 % Percoll ) 에 걸친 원심 분리 에 의해 PBMCs 로부터 모노 사이트 를 준비 하 였 다 . 상위 경 계면 으로부터 모노 사이트 를 거두 고 RPMI 1640 ( 10 % FCS ) 배지 로 3 회 세척 하 고 2 . 4 mM L - 글루타민 ( Sigma - Aldrich ) , 100 U / ml 페니실린 - 스트렙토마이신 ( Gibco ) , 휴먼 재조합 GM - CSF ( Peprotech ) 100 ng / ml 및 휴먼 재조합 IL - 4 ( Strathmann - Biotec AG ) 50 ng / ml 이 보충 된 RPMI 1640 ( 10 % FCS ) 으로 6 웰 플 래 이트 ( 각 웰 당 4 ml , 0 . 5 x 106 cells / ml ) 에서 배양 하 였 다 . 배양 6 일 후 , 미성숙 DC ( imDC ) 를 수거 하 였으며 , 이 는 CD 14 및 CD 83 에 대해 음성 이 었 으며 , 플로우 사이토 메트리 로 측정 시 저 수준 의 CD 86 및 HLA - DR 을 발현 하 였으며 , 그리고 고 수준 의 CD 40 및 CD 11 c 를 발현 하 였 다 .