고 복제 수 를 가지 는 플라스미드 를 스크리닝 하 기 위하 여 플라스미드 의 ctRNA 부분 을 error prone PCR 방법 을 이용 하 여 무작위 변형 을 하 였 다 . Error prone PCR 은 dATP , dCTP , dGTP , dTTP 과 MgCl 2 를 농도 를 다르 게 사용 하 여 약 1 % 의 Error rate 을 가지 도록 변형 을 주 었 다 . 플라스미드 는 고복 제수 를 위해 orfA 2 ( parB ) 의 21 번 째 위치 를 아데닌 ( A ) 으로 변이 한 pHCP 플라스미드 ( 한국 공개 공보 10 - 2018 - 0092110 ) 를 이용 하 였 다 . 본 출원 에서 는 기존 pHCP 보다 높 은 복제 수 의 플라스미드 를 얻 고자 하 였 고 , 이 를 위하 여 pHCP 의 ctRNA 부분 인 98 bp 의 서열 을 무작위 변경 하 고자 하 였 다 . 무작위 변형 부분 은 pHCP 의 ctRNA 부분 을 포함 하 고 있 으며 ( 도 1 ) , ctRNA 변경 서열 을 포함 하 고 있 는 PCR 산물 의 앞 뒤 에 있 는 NcoI , EcoRI 제한 효소 부위 를 이용 하 여 무작위 변형 된 ctRNA 부분 PCR 산물 을 원래 의 pHCP 플라스미드 의 동일 한 제한 효소 자리 로 교체 함 으로써 다양 한 복제 수 의 플라스미드 라이브러리 를 구축 하 였 다 . 플라스미드 라이브러리 는 대장균 에서 1 . 4 x 107 크기 로 구축 되 었 고 , 만들 어 진 플라스미드 들 은 회수 하 여 목적 하 는 코 리네 박 테리 움 글루 타미 쿰 숙주 에서 2 x 104 크기 로 라이브러리 구축 하 여 스크리닝 에 이용 하 였 다 .