주 르 카트 세포 를 10 % 태아 소 혈청 ( Gibco ) 을 함유 하 는 RPMI 배지 내 에서 성장 시키 고 , 다음 과 같이 Invitrogen Neon 전기 천 공 시스템 을 이용 하 여 형질 감염 시켰 다 . 모든 단계 는 실온 에서 수행 되 었 다 . 대략 1 . 4 × 107 개 의 세포 가 1000 rpm 에서 3 분 동안 원심 분리 되 었 다 . 상등 액 을 제거 하 고 , 세포 를 칼슘 또는 마그네슘 ( Gibco ) 없이 PBS 로 2 회 세척 하 고 상기 와 같이 원심 분리 하 였 다 . 세포 를 1 . 3 ml 의 R 재현 탁 완충액 중 에 재현 탁 시키 고 , 네온 ( Neon ) 형질 감염 시스템 100 ㎕ 키트 ( cat . # MPK 10096 ) 내 에 제공 하 였 다 . 100 ㎕ 의 대략 106 개 의 주 르 카트 세포 를 함유 하 는 세포 현탁액 이 각각 의 전기 천공 에 사용 되 었 다 . 각각 의 DNA 구축물 ( 최소 DNA 농도 0 . 73 ㎍/㎕; 최대 DNA 농도 1 . 48 ㎍/㎕) 에 대해 최대 부피 10 ㎕ 를 세포 분배 전 에 1 . 5 ml 튜브 에 첨가 하 였 다 . 혼합물 을 부드럽 게 혼합 하 고 , 네온 팁 안 으로 빨아들였 다 . 세포 와 DNA 혼합물 을 3 ml 의 전기분 해 완충액 E 2 로 충전 된 네온 전기 천 공 튜브 내 에서 1600 볼트 , 10 ms 및 3 펄스 의 설정 으로 전기 천공 시키 고 , 네온 형질 감염 시스템 키트 내 에 제공 되 었 다 . 세포 를 이후 6 웰 디쉬 내 2 ml RPMI / 10 % FBS 내 로 넣 고 , 37 ℃ 및 5 % CO 2 에서 하룻밤 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 제 2 일 에 , 각각 의 웰 의 세포 를 피펫 으로 올렸 다 내렸 다 하 고 , 12 웰 디쉬 의 2 개 웰 내로 ( 각각 1 ml ) 이동 시켰 다 . 하나 의 웰 은 미 자극 된 채 로 두 었 고 , 다른 하나 의 웰 은 여러 시간 기간 동안 PMA ( 50 ng / ml ) 및 아이 오노 마이신 ( Ionomycin ) ( 1 ㎍/ ml ) 으로 자극 시켰 다 . GFP 리포터 의 발현 을 FL 1 채널 내 에서 유세포 분석기 ( Accuri , BD Biosystems ) 에 의해 6 시간 , 18 시간 또는 48 시간 에 판독 하 였 다 . 세포 의 활성 화 상태 를 항 - 인간 CD 69 염색 을 이용 하 여 결정 하 였 다 ( 문헌 [ Browning , J . L et al . 1997 . J . Immunol . 159 : 3288 - 3298 ] ) .