세드 롤 처리 후 복제 개시 인자 인 엠씨 엠 단백질 발현 저하 를 확인 하 기 위해 세드 롤 로 처리 된 HT 29 세포 ( 2 × 105 cells ) 를 CSK 완충액 ( 10 mM pipes pH 6 . 8 , 100 mM NaCl , 1 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA , 1 mM dithiothreitol , 1 mM phenylmethanesalfonyl fluoride , 0 . 1 % Triton X - 100 , 1 mM ATP 및 proteinase inhibitors ) 100 ㎕ 에 현 탁 하 였 다 . 세포 현탁액 을 4 ℃ 에서 30 분 간 초음파 처리 하 여 세포 를 파쇄 시킨 후 원심 분리 하 여 단백질 을 추출 하 였 다 . 단백질 추출 액 은 정량 하 여 동일 량 의 단백질 ( 3040 ㎍) 로 조정 하 여 SDS 가 함유 된 샘플 완충액 ( sample buffer ) 으로 변성 시킨 후 , SDS 폴리아 크릴 아마이드 겔 ( polyacrylamide gel ; 10 % 엠씨 엠 - 2 , - 3 , - 4 , - 6 , - 7 , 15 % PCNA ) 을 사용 하 여 전기영동 을 행하 였 다 . 그 후 겔 상 에 존재 하 는 시료 단백질 은 PVDF 막 ( PALL , FL ) 에 전사 시키 고 그 막 은 블로킹 용액 ( BlockaceTM , Dai - Nippon ) 에 희석 시킨 1 차 항체 와 4 ℃ 에서 12 시간 이상 반응 시켰 다 . 그 후 TBS 용액 ( Tris buffered saline ; 0 . 15 M NaCl , 0 . 1 % Triton X - 100 및 50 mM Tris / HCl , pH 7 . 5 ) 으로 세척 하 였 다 . 세척 되 어 진 막 은 페록시다아제 ( peroxidase ) 가 결합 된 2 차 항체 와 빈 응시 킨 후 화학 반응 시스템 ( chemiluminescene system ; Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate , Pierce ) 을 이용 하 여 항체 와 반응 되 어 진 단백질 을 검출 하 고 반응 의 레벨 은 단백질 양 의 측정 ( FluorchemTM 5500 , Alpha Innotech ) 을 통하 여 확인 하 였 다 .