구체 적 으로 , HEK 293 T 세포 ( ATCC ) 에 pCAG - Flag - Oct 4 , pCAG - Flag - Oct 4 S 229 A mutant , pCAG - Flag - Oct 4 S 229 D mutant 발현 플라스미드 ( Expression plasmid ) 를 Polyethyleneimine ( PEI , Sigma ) 를 통해 트랜스펙션 ( Transfection ) 하 여 각각 의 단백질 을 세포 에서 과 발현 ( over - expression ) 시켰 다 . 각각 의 단백질 이 과 발현 된 HEK 293 T 세포 들 은 protease inhibitor cocktail kit ( P 3100 - 005 ; GenDEPOT , Barker , TX ) 및 NaF 를 포함 한 세포 용해 를 사용 하 여 분해 하 였 다 . 50 ug 의 세포 용해 물 ( whole cell lysates ) 을 포함 하 는 부분 표본 은 SDS - polyacrylamide 젤 상 에서 전기영동 하 여 분리 하 였 고 , 그리고 나 서 transfer buffer ( 25 mM Tris , 192 mM glycine , 10 % [ v / v ] methanol [ pH 8 . 3 ] ) 상 에서 80 V 에서 120 분 동안 PVDF membrane ( Atto ) 으로 이동 시켰 다 . 막 은 상온 에서 60 분 동안 0 . 1 % ( v / v ) Tween - 20 를 포함 하 는 5 % ( w / v ) skim milk 의 PBS 로 블 락킹 하고 , 그리고 나 서 항 - 인산화 Oct 4 ( S 229 ) , 항 - Oct 4 ( Santacruz ) , 항 - Flag ( Sigma ) , 항 - β - actin ( Sigma ) 항체 와 각각 배양 하 였 다 . 이 차 항체 에 는 HRP - 결합 된 염소 항 - 토끼 IgG ( 1 : 5000 ; Thermo ) 또는 염소 항 - 마우스 IgG ( 1 : 5000 ; Thermo ) 가 사용 되 었 으며 ECL kit ( Thermo Fisher Scientific ) 을 사용 하 여 블롯 들 을 현상 하 였 다 .