96 웰 역가 용 미세 플레이트 ( Maxisorp ® Nunc ) 를 코팅 완충액 에 용해 시킨 탯줄 HA ( Sigma Chemical Co ) ( 100 ㎕/ well ) 을 사용 하 여 4 ℃ 에서 밤새 코팅 시켰 다 . 코팅 되 지 않 은 영역 을 60 분 동안 25 ℃ 에서 포스 페이트 완충 염수 ( PBS ) 에 녹인 1 % ( w / v ) BSA 을 150 ㎕/ well 로 사용 하 여 블록 킹 시켰 다 . PBS - Tween 으로 세척 한 후 에 , 검출 할 시료 100 ㎕ 기준 경 합체 ( HA Healon ® 범위 19 . 53 - 10 , 000 ng / ml ) 을 바이오틴 이 컨 쥬게 이 션 된 - HA - 결합 단백질 ( 1 : 200 ) 과 함께 첨가 하 였 다 . 60 분 동안 25 ℃ 에서 배양 한 후 에 , 플레이트 를 세 척하 고 그 다음 에 페록시다아제 - 마우스 단일 클론 항 - 바이오틴 ( Invitrogen ) ( 100 ㎕/ well ; 1 : 4 , 000 ) 을 첨가 하 였으며 , 이 혼합물 을 60 분 동안 25 ℃ 에서 배양 하 였 다 . 이 플레이트 를 다시 세척 한 후 에 페록시다아제 기질 ( Invitrogen ) ( 100 ㎕/ well ) 을 첨가 하 고 10 - 20 분 동안 37 ℃ 에서 배양 하 여 발색 되 도록 하 였 다 . 이 반응 을 50 ㎕ 의 4 M H 2 SO 4 를 첨가 하 여 중지 시켰 다 . 492 / 690 nm 에서 흡광도 를 티 터 르 테크 멀티 스캔 M 340 멀티 플레이트 리더 ( Titertek Multiskan M 340 multiplate reader ) 로 측정 하 였 다 .