상기 전기영동 이 끝난 겔 은 트랜스퍼 완충 용액 ( transfer buffer ; 39 mM 글리신 , 2 . 9 g , 48 mM 트리스 - 염기 , 5 . 8 g , 0 . 037 % SDS , 20 % 메탄올 ; pH 8 . 3 ) 에 미리 적신 니트 로 셀룰로스 멤 브레인 ( nitrocellulose membrane , NC ) 을 올려놓 은 후 파이버 패드 ( fiber pad ) 에 넣 고 조립 하 였 다 . 그리고 나 서 면역 블 럿팅 트랜스퍼 카세트 ( immunoblotting transfer cassette ) 를 NC 멤 브레인 이 양극 ( positive charge ) 방향 으로 , 겔 이 음극 ( 음성 charge ) 방향 으로 오 도록 맞추 어 트랜스퍼 쳄버에 넣 어 두 었 다 . 전류 는 1 A 로 공급 하 고 , 온도 는 쿨링 시스템 을 사용 하 여 4 ℃ 를 유지 하 면서 1 시간 30 분 간 트랜스퍼 시켰 다 . 상기 NC 페이퍼 는 블로킹 완충 용액 ( blocking buffer ; 5 % 비 지방 분유 ( nonfat dry milk ) ) 를 녹인 TBS - T 완충 용액 ( 20 mM 트리스 - HCl pH 7 . 5 , 150 mM NaCl , 0 . 05 % 트윈 - 20 ) 약 200 ㎖ 에 1 시간 동안 Red - Rocker ( 미국 Hoefer 사 제품 ) 로 로킹 하 여 항체 ( antibody ) 의 비 특이 적 결합 ( non - specific binding ) 을 블로킹 한 다음 , 다시 TBS - T 완충 용액 으로 15 분 간 1 회 , 10 분 간 2 회 세척 하 였 다 . 그 후 , 3 ㎖ TBS - T 완충 용액 을 실리콘 용기 ( siliconized bottle ) 에 분주 하 고 여기 에 토끼 항 - 생쥐 phospho - NF - κ B 다 클론 일 차 항체 ( rabbit anti - murine phospho - polyclonal primary antibody ; 500 ㎍/ 1 . 5 ㎖ 농도 로 PBS 완충 용액 에 녹 임 ) 30 ㎕ ( 1 : 300 의석 ) 를 첨가 한 후 , NC 페이퍼 를 실리콘 용기 에 넣 어 4 ℃ 하이브 리디 제이션 항온기 ( hybridization incubator ; 미국 Robbins 사 제품 ) 에서 10 rpm 으로 12 시간 동안 반응 시켰 다 . 배양 한 후 , 70 ㎖ TBS - T 완충 용액 으로 20 분 간 각각 3 번 하이 브리디 제이션 항온기 ( hybridization incubator ) 에서 12 rpm 속도 로 씻 어 낸 후 , 이 차 항체 ( secondary antibody ) , 즉 염소 항 - 토끼 IgG 호스 래 디쉬 퍼 옥시 다제 결합 을 이용 하 여 친화 분리 된 항체 ( goat anti - rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody ; PBS 완충 용액 에 0 . 02 ㎎/ 4 ㎖ 농도 로 녹인 스톡 용액 ) 를 3 ㎖ TBS - T 완충 용액 에 30 ㎕ ( 1 : 20 , 000 희석 ) 을 첨가 하 여 4 ℃, 하이브 리디 제이션 항온기 에서 3 시간 동안 배양 하 였 고 , 70 ㎖ TBS - T 완충 용액 으로 20 분 간 각각 4 번 씻 어 내 었 다 . 씻 은 후 , NC 페이퍼 를 얇 고 투명 한 비 닐 에 넣 고 ECL ( peroxidase substrate ) 반응 액 1 및 2 를 50 % 씩 혼합 한 3 ㎖ 을 NC 페이퍼 에 분주 한 다음 5 분 간 배양 하 였 다 . 그 후 , 암실 ( 10 W safety lamp ; 미국 Kodak 사 제품 ) 에서 NC 가 들 어 있 는 카세트 에 X - ray 필름 을 넣 고 5 분 또는 10 분 이상 감광 시킨 후 X - ray 필름 을 현상 용 박스 내 의 현상 용액 ( develop solution ) 에 넣 어 약 3 분 간 반응 시킨 다음 , 이 X - ray 필름 을 다시 물 에서 2 분 간 세척 한 후 , 고정 용액 ( fixing solution ) 에서 3 분 간 반응 시키 고 다시 2 분 간 물 로 세척 하 여 나타나 는 밴드 ( band ) 를 분석 하 였 다 .