세포 증식 및 표현 형 검사 ( phenotyping ) . RNP 전달 후 2 일 째 에 , 살 아 있 는 세포 를 LSRFortessa ( BD Biosciences ) 상 에서 TruCount 튜브 ( BD Biosciences Cat # 340334 ) 를 제조 업체 의 권고 사항 에 따라 사용 한 유세포 분석 에 의해 나열 하 였 다 . 살 아 있 지 않 은 세포 를 DAPI ( 4 ', 6 - 디아 미 디노 - 2 - 페닐 인돌 ) 를 사용 하 여 구별 하 고 , CD 34 + 및 CD 34 + CD 90 + 세포 를 결정 하 였 다 . 2 % FBS ( Omega Scientific , Cat . # FB - 11 ) 및 2 mM EDTA ( Corning Cat . # 46 - 034 - CL ) 가 보충 된 HBSS ( GE Life Sciences , Cat . # SH 30588 . 01 ) 로 구성 된 FACS 염색 완충제 중 항 - CD 34 ( BD Biosciences Cat # 348057 , BD Biosciences Cat # 340666 또는 eBioscience Cat # 25 - 0349 - 425 ) 및 항 - CD 90 ( BD Biosciences Cat # 559869 ) 의 포함 에 의해 함량 을 결정 하 였 다 . FlowJo 소프트웨어 ( Tree Star ) 를 사용 하 여 분석 을 수행 하 였 다 . 그 후 에 , 세포 를 2 . 0 x 104 또는 1 . 0 x 105 개 살 아 있 는 세포 / ml 로 확장 배지 내 로 접종 하 고 , 7 일 동안 배양 하 였 다 . 1 . 0 x 105 / ml 로 접종 된 배 양물 에 대해 , 배양 기간 동안 3 또는 4 배 희석 을 위해 신선 한 배지 를 첨가 하 였 다 . 7 일 배양 후 , 세포 를 일단 상기 와 같이 다시 나열 하 였 다 . 7 일 배양 후 , 세포 를 부가 적 으로 , 하 기 항체 패널 을 이용 한 염색 후 표면 마커 발현 에 대해 분석 하 였 다 . 패널 1 : CD 38 ( FITC - 공 액체 , BD Biosciences # 340926 , 클론 HB 7 ) , CD 133 에 피토프 1 ( PE - 공 액체 , Miltenyi # 130 - 080 - 801 , 클론 AC 133 ) , CD 34 ( PerCP - 공 액체 , BD Biosciences # 340666 , 클론 8 G 12 ) , CD 90 ( APC - 공 액체 , BD Biosciences # 559869 , 클론 5 E 10 ) , CD 45 RA ( Pe - Cy 7 - 공 액체 , eBioscience # 25 - 0458 - 42 , 클론 HI 100 ) . 패널 2 : CD 34 ( PerCP - 공 액체 , BD Biosciences # 340666 , 클론 8 G 12 ) , CD 33 ( PE - Cy 7 - 공 액체 , BD Biosciences # 333946 , 클론 P 67 . 6 ) , CD 14 ( APC - H 7 - 공 액체 , BD Biosciences # 560270 , 클론 M φ P 9 ) , CD 15 ( PE - 공 액체 , Biolegend # 301905 , 클론 HI 98 ) . 패널 3 : CD 34 ( PerCP - 공 액체 , BD Biosciences # 340666 , 클론 8 G 12 ) , CD 41 a ( APC - H 7 - 공 액체 , BD Biosciences # 561422 , 클론 HIP 8 ) , CD 71 ( FITC - 공 액체 , BD Biosciences # 555536 , 클론 M - A 712 ) , CD 19 ( PE - 공 액체 , BD Biosciences # 340720 , 클론 SJ 25 C 1 ) , CD 56 ( APC - 공 액체 , Biolegend # 318310 , 클론 HCD 56 ) 에 특이 적 인 항체 . 상응 하 는 이 소형 대 조군 항체 패널 을 사용 하 여 , 염색물 을 병행 하 여 염색 시켰 다 . 살 아 있 지 않 은 세포 를 DAPI ( 4 ', 6 - 디아 미 디노 - 2 - 페닐 인돌 ) 염색 에 의해 구별 하 였 다 . 염색 된 시료 를 LSRFortessa 유세포 분석기 ( BD Biosciences ) 상 에서 세포 표면 단백질 발현 에 대해 분석 하 였 다 . 결과 를 Flowjo 를 사용 하 여 분석 하 고 , 데이터 를 DAPI 음성 살 아 있 는 세포 집단 의 % 로서 제시 하 였 다 .