인간 FcRn 의 IgG 1 - 7 D 8 항체 변이체 에 의 결합 에 대한 Fc - Fc - 증진 돌연변이 와 C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 K 326 A / E 333 A 또는 K 326 W / E 333 S 의 조합 도입 의 효과 를 평가 하 기 위해 FcRn 결합 ELISA 를 수행 하 였 다 . IgG 1 - 7 D 8 - I 235 A / H 310 A / H 435 A 를 FcRn 결합 에 대한 음성 대 조군 ( FcRn 녹아웃 ; 문헌 [ Shields et al . , J . Biol . Chem . 2001 ; 276 : 6591 ] ) 으로서 사용 하 였 고 ; IgG 1 - 7 D 8 - M 252 Y / S 254 T / T 256 E 를 증진 된 FcRn 결합 에 대한 대 조군 ( Dall ' Acqua et al . , J Biol Chem . 2006 Aug 18 ; 281 ( 33 ) : 23514 - 24 ) 으로서 사용 하 였 다 . 모든 인 큐 베이 션 을 실온 에서 수행 하 였 다 . 96 스 트 렙 타 웰 플레이트 ( 로슈 , 카탈로그 번호 1734776001 ) 를 PBST 플러스 0 . 2 % BSA 로 희석 된 , 인간 FcRn 의 재조합 적 으로 생산 된 비오티 닐 화 된 세포 외 도메인 ( FcRnECDHis - B 2 M - BIO , 즉 이량체 로서 베타 2 마이크 로 글로불린 을 갖 는 C - 말단 His 및 BAP 태그 를 갖 는 인간 FcRn 의 세 포외 도메인 ) 5 μ g / mL ( 100 μ L / 웰 ) 로 1 시간 동안 코팅 하 였 다 . 플레이트 를 PBST 로 3 회 세척 하 였 다 . 연속 희석 된 항체 샘플 ( PBST / 0 . 2 % BSA , pH 6 . 0 중 3 배 희석 으로 범위 0 . 003 - 10 μ g / mL 최종 농도 ) 을 첨가 하 고 , 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 PBST / 0 . 2 % BSA , pH 6 . 0 으로 세척 하 였 다 . PBST / 0 . 2 % BSA , pH 6 . 0 또는 7 . 4 로 희석 된 양 고추냉이 퍼 옥시 다제 ( HRP ) - 접합 된 폴리 클로 날 염소 - 항 - 인간 IgG ( 1 : 10 , 000 ; 잭슨 이 뮤 노리 서 치 , 카탈로그 번호 109 - 035 - 097 ) 를 첨가 하 고 , 플레이트 를 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 세 척 후 , 100 μ L ABTS ( 1 mg / mL ) 를 기질 로서 첨가 하 고 , 플레이트 를 빛 으로부터 보호 하 면서 30 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 100 μ L 2 % 옥살산 을 사용 하 여 반응 을 정지 시키 고 , ELx 808 흡광 도 마이크 로 플레이트 판독기 ( 바이오 텍 ) 를 사용 하 여 405 nm 에서 흡광도 를 측정 하 였 다 . 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 를 사용 하 여 가변 기울기 를 갖 는 S 자형 용량 - 반응 곡선 에 피팅 함 으로써 log - 변환 된 데이터 를 분석 하 였 다 . 음성 대 조군 ( IgG 1 - 7 D 8 - I 235 A / H 310 A / H 435 A ) 은 pH 6 . 0 에서 인간 FcRn 결합 의 완전 한 상실 을 나타낸 반면 ( 도 21 A ) , 양성 대 조군 ( IgG 1 - 7 D 8 - M 252 Y / S 254 T / T 256 E ) 은 pH 6 . 0 에서 는 WT IgG 1 - 7 D 8 과 비교 하 여 인간 FcRn 에 대한 증진 된 결합 을 나타냈 고 pH 7 . 4 에서 는 결합 의 상실 을 나타냈 다 ( 도 21 B ) . C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 를 갖 거나 갖 지 않 으면서 Fc - Fc - 증진 돌연변이 를 갖 는 모든 시험 된 IgG 1 - 7 D 8 변이체 는 pH 6 . 0 에서 인간 FcRn 에 대한 효율 적 인 결합 및 pH 7 . 4 에서 결합 의 상실 을 나타냈 다 . 그러나 , WT IgG 1 - 7 D 8 과 비교 하 여 , Fc - Fc - 증진 돌연변이 E 430 G 단독 의 도입 은 pH 6 . 0 에서 인간 FcRn 에 대한 약간 감소 된 결합 을 유발 하 였으며 , 이 는 C 1 q 결합 - 증진 돌연변이 K 326 A / E 333 A 또는 K 326 W / E 333 S 돌연변이 와 조합 하 였을 때 약간 더 감소 되 었 다 .