사용 된 모든 프라이머 를 표 2 에 기재 하 였 다 . PCR 반응 을 위한 크로 모조 멀 주형 DNA 는 증류수 50 ㎕ 에 ~ 109 박테리아 를 리서 스펜 딩 시키 고 , 이후 서스펜션 을 95 ℃ 에서 15 분 간 가열 하 여 제조 되 었 다 . 그 다음 상기 서스펜션 을 16 , 100 x g 에서 1 분 간 원심 분리 한 후 , 상층 액 을 주형 DNA 로 사용 하 였 다 . B . 페르투 시스 돌연변이 스트레인 B 213 Δ BP 2328 및 Δ BP 2329 를 제작 하 기 위해 , 모두 BamHI 사이트 를 가진 프라이머 BP 2328 _ FWup , BP 2329 _ FWup , 및 프라이머 BP 2328 _ REVup 및 BP 2329 _ REVup 을 이용 하 여 이 에 상응 하 는 ORFs 의 5 ' 리전 및 업 스트림 서열 을 포함 하 는 DNA 세그먼트 를 증폭 시켰 다 . 또한 , 상기 ORFs 의 3 ' 리전 및 다운 스트림 서열 을 함유 하 는 DNA 프레 그 먼 트 는 모두 BamHI 사이트 를 가진 프라이머 BP 2328 _ FWdown , BP 2329 _ FWdown , 및 프라이머 BP 2328 _ REVdown and BP 2329 _ REVdown 을 이용 한 PCR 을 통해 획득 되 었 다 . B . 페르투 시스 BP 2331 돌연변이 스트레인 을 제작 하 기 위해 , 이 에 상응 하 는 ORF 는 프라이머 BP 2331 _ FW 및 BP 2331 _ REV 를 이용 하 여 증폭 되 었 다 . PCR 은 각 프라이머 5 pmol 과 함께 총 반응 체적 25 ㎕ 에서 순수 Taq Ready - to - go PCR 비드 ( Amersham Biosciences ) 를 이용 하 여 수행 되 었 다 . 온도 프로그램 은 다음 과 같 다 : 95 ℃ 에서 3 분 , 95 ℃ 에서 15 초 30 싸이클 , 55 ℃ 에서 30 초 , 및 72 ℃ 에서 1 분 , 그 다음 72 ℃ 에서 7 분 및 후속 적 인 4 ℃ 냉각 . PCR 산물 은 아가 로즈 겔 로부터 정제 되 고 , 후속 적 으로 pGEM - T Easy 내 로 클로닝 되 어 그 결과 각각 , 플라스미드 pGEM - BP 2328 up , pGEM - BP 2328 down , pGEM - BP 2329 up , pGEM - BP 2329 down 및 pGEM - BP 2331 이 생성 되 었 다 . pGEM - BP 2328 down 및 pGEM - BP 2329 down 의 BamHI - SpeI 프레 그 먼 트 는 각각 , BamHI - SpeI - 제한 된 pGEM - BP 2328 up 및 pGEM - BP 2329 up 내 로 라 이게 이 션 되 었 다 . 그 결과 플라스미드 및 플라스미드 pGEM - BP 2331 은 각각 , BamHI 및 HindIII 다 이제 션 에 의해 획득 되 는 플라스미드 pBSL 128 의 카나마이신 내성 카세트 의 삽입 이 이루어지 도록 각각 , BamHI 및 EcoRV 로 절단 되 었 다 . 최종 적 으로 , 획득 된 구조물 의 EcoRI 프레 그먼 트 는 EcoRI - 제한 된 자살 플라스미드 pSS 1129 내로 라 이게 이 션 되 었 다 . 각각 pSS 1129 - BP 2328 KO , pSS 1129 - BP 2329 KO 및 pSS 1129 - BP 2331 KO 로 명명 된 최종 구조물 들 은 상기 오페론 의 전사 방향 과 동일 한 방향 으로 카나마이신 - 내성 카세트 를 함유 하 였 다 . pSS 1129 - 계 플라스미드 들 은 E . 콜라 이 SM 10 ( λ pir ) 을 형질 변형 시키 기 위해 사용 되 었 으며 , 이 는 대립 교환 에 의한 상기 플라스미드 들 의 B . 페르투 시스 및 B . 페르투 시스 BP 2328 , BP 2329 및 BP 2331 돌연변이 의 구조물 로 의 후속 적 인 이동 을 가능 케 하 였 다 . 형질 변형체 들 은 다양 한 프라이머 세트 를 이용 한 PCR 을 통해 스크리닝 되 었 다 .