다음 으로 , VNEL 및 VNEQ 변이체 의 온 - 타 겟 활성 을 , 293 멀티 GFP 리포터 세포주 를 사용 하 여 EGFP 코딩 서열 의 상이 한 영역 을 타 겟 팅 하 고 , EGFP 형광 의 소실 을 측정 함 으로써 보다 상세 하 게 평가 하 였 다 . VNES 변이체 는 그것 이 VNEQ 돌연변이체 와 유사 하 게 거동 하 였 기 때문 에 분석 으로부터 제외 되 었 다 . 이전 의 결과 ( 도 5 c ) 에 따라 , 본 발명자 들 은 VNEQ 에 대한 활성 의 야생 형 수준 을 관찰 한 반면 , VNEL 은 시험 된 로커스 중 하나 에 대해 활성 의 유의 한 강하 를 갖 는 , 일부 의 부위 에서 약간 성능 저하 되 었 다 ( 도 6 a 및 6 b ) . 온 - 및 오프 - 타 겟 부위 에 대해 측정 된 상이 한 절단 거동 이 SpCas 9 변이체 의 세포내 수준 의 변경 에 기인 하 였을 가능 성 을 배제 하 기 위해 , 야생 형 SpCas 9 , VNEL 및 VNEQ , 뿐 만 아니 라 2 가지 이전 에 공개 된 고 - 충실 도 변이체 eSpCas 9 ( 1 . 1 ) 및 SpCas 9 - HF 1 의 단백질 수준 을 동등 한 양 의 발현 플라스미드 로 형질 감염 된 293 T 세포 에서 분석 하 였 다 . 결과 ( 도 6 c ) 에 의해 명백 하 게 제시 된 바 와 같이 , 단백질 수준 의 주요 한 차이 는 관찰 되 지 않 았 다 . 이 들 결과 를 고려 하 여 , VNEQ 변이체 를 , 여기 서 분석 된 돌연변이체 중 에서 그것 이 거의 야생 형 수준 의 활성 을 보유 하 였으며 , EGFP - 붕괴 세포 모델 에서 의 비 - 매칭 서열 의 절단 을 극 적 으로 감소 시켰 기 때문 에 추가 로 특징 화 하 였 다 . VNEQ 돌연변이체 를 evoCas 9 ( 진화 된 Cas 9 ) 로 명명 하 였 다 .