구체 적 으로 , 참고 예 1 의 E 14 배아줄기세포 를 protease inhibitor cocktail kit ( P 3100 - 005 ; GenDEPOT , Barker , TX ) , 및 NaF 를 포함 한 Cell lysis buffer ( 150 mM NaCl , 25 mM Tris - HCl [ pH 8 . 0 ] , 1 mM EDTA , 0 . 1 % NP 40 ) 를 사용 하 여 분해 하 였 다 . 1 mg 의 세포 용해 물 ( whole cell lysates ) 을 포함 하 는 부분 표본 은 각각 Rabbit IgG ( Santacruz ) 또는 상기 제작 한 항체 로 4 ℃ 에서 4 시간 동안 배양 하 였 다 . 그 후 Protein A plus agarose bead ( Santacruz ) 로 pull down 하 였 다 . Pull down 된 sample 은 SDS - polyacrylamide 젤 상 에서 전기영동 하 여 분리 하 였 고 , 그리고 나 서 transfer buffer ( 25 mM Tris , 192 mM glycine , 10 % [ v / v ] methanol [ pH 8 . 3 ] ) 상 에서 80 V 에서 120 분 동안 니트 로 셀 루 로즈 막 ( Amersham , Buckinghamshire , UK ) 으로 이동 시켰 다 . 80 V 에서 120 분 동안 PVDF membrane ( Atto ) 으로 이동 시켰 다 . 막 은 상온 에서 60 분 동안 0 . 1 % ( v / v ) Tween - 20 를 포함 하 는 5 % ( w / v ) Milk 의 PBS 로 블 락킹 하고 , 그리고 나 서 각각 상기 제작 한 항 - 인산화 Oct 4 ( S 229 ) 와 항 - Oct 4 ( Santacruz ) 항체 를 배양 하 였 다 . 이 차 항체 는 HRP - 결합 된 염소 항 - 토끼 IgG ( 1 : 5000 ; Thermo ) 또는 염소 항 - 마우스 IgG ( 1 : 5000 ; Thermo ) 를 사용 하 였 고 , 그리고 나 서 ECL kit ( Thermo Fisher Scientific ) 를 사용 하 여 블롯 들 을 현상 하 였 다 .