시험관 내 ( DIV ) 제 4 일 에 , 래트 해마 뉴런 을 A 53 T 돌연변이 를 보유 하 는 인간 α Syn 에 대한 cDNA 를 함유 하 는 아데 노 - 연관 바이러스 벡터 , AAV 1 ( 진디 텍 트 ( GeneDetect ) , 플로리다주 브레이든턴 ) 로 MOI 3 , 000 으로 형질 도입 하 였 다 . DIV 제 7 일 에 세포 를 시험 샘플 로 처리 하 였 다 ( 처리 당 6 개 의 웰 ) . 모든 처리 는 절반 배지 교환 에 의해 행하 였 다 . 각각 의 플레이트 는 음성 대 조군 ( 비 처리 상태 ) , 양성 대 조군 ( 10 nM PFF ) 및 비 - 고갈 된 유도 인 자 대 조군 을 함유 하 였 다 . DIV 제 18 일 에 ( 처리 11 일 후 ) , 세포 를 고정 시키 고 , 불용성 α Syn 에 대해 염색 하 였 다 . 고정 을 위해 , 4 % 파라포름알데히드 및 4 % 수크로스 및 1 % 트리톤 을 함유 하 는 용액 을 15 분 동안 첨가 하 였 다 . 고정 후 , DPBS 플러스 0 . 05 % 트윈 을 함유 하 는 세척 완충제 로 세포 를 3 회 세척 하 였 다 . 이어서 , 세포 를 DPBS 중 3 % BSA 및 0 . 3 % 트리톤 으로 1 - 2 시간 동안 차단 하 여 비 - 특이 적 신호 를 차단 하 였 다 . 차단 단계 후 , 세포 를 차단 완충제 중 에서 밤새 1 차 항체 로 처리 하 였 다 . 사용 된 1 차 항체 는 항 - aSyn 및 베타 시뉴 클레인 ( EP 1646 Y , 밀리 포어 ( Millipore ) / 압 캠 ( Abcam ) ; 영국 캠 브리지 ; N - 말단 토끼 모노클 로 날 , 1 : 100 희석 ) , 항 - α Syn , 포스 포 S 129 ( 81 A , 코 반스 ( Covance ) / 바이오 레전드 ( Biolegend ) , 보가르 트 ( Bogart ) , GA 마우스 모노클 로 날 , 1 : 1000 희석 ) , 및 항 - MAP 2 ( ab 5392 , 압 캠 ; 영국 캠 브리지 ; 닭 폴리 클로 날 , 1 : 10 , 000 희석 ) 이 었 다 . 다음 날 , 플레이트 를 0 . 05 % 트윈 을 함유 하 는 DPBS 로 3 회 세척 한 후 형광 - 접합 된 2 차 항체 와 1 시간 인 큐 베이 션 하 였 다 . 사용 된 2 차 항체 는 알렉사 플루오르 ( Alexa Fluor ) 647 염소 항 - 마우스 IgG , 1 : 500 희석 ; 알렉사 플루오르 488 염소 항 - 토끼 IgG , 1 : 500 희석 , 알렉사 플루오르 568 염소 항 - 닭 IgG , 1 : 500 희석 및 훽 스 트 , 1 : 800 희석 이 었 다 . 모든 2 차 항체 는 인 비트 로 젠 으로부터 입수 하 였 다 . 이어서 플레이트 를 DPBS 플러스 0 . 05 % 트윈 으로 각각 15 분 동안 3 회 세척 하 였 고 , DPBS 단독 으로 최종 세척 하 였 다 .