미리 조제 해 둔 대장균 JM 109 주 컴 피턴 트 셀 ( 대장균 JM 109 주 를 LB 배지 ( 1 % 박토 트립 톤 , 0 . 5 % 박토 이스트 추출물 , 0 . 5 % NaCl ) 1 ㎖ 에 접종 하 고 37 ℃, 5 시간 호기 적 으로 전 ( 前 ) 배양 한 후 , 전 배양액 0 . 4 ㎖ 를 SOB 배지 40 ㎖( 2 % 박토 트립 톤 , 0 . 5 % 박토 이스트 추출물 , 10 mM NaCl , 2 . 5 mM KCl , 1 mM MgSO 4 , 1 mM MgCl 2 ) 에 가하 여 18 ℃ 에서 20 시간 배양 하 고 , 얻 어 진 배 양물 을 원심 분리 ( 3 , 700 ×g , 10 분 간 , 4 ℃) 에 의해 집 균 한 후 , 냉 TF 용액 ( 20 mM PIPES - KOH ( pH 6 . 0 ) , 200 mM KCl , 10 mM CaCl 2 , 40 mM MnCl 2 ) 을 13 ㎖ 가하 여 0 ℃ 에서 10 분 간 방치 하 고 , 다시 원심 분리 ( 3 , 700 ×g , 10 분 간 , 4 ℃) 하 여 상청 을 제거 하 고 , 얻 어 진 대장균 균체 를 냉 TF 용액 3 . 2 ㎖ 에 현 탁 하 고 , 0 . 22 ㎖ 의 다이메틸 설 폭사 이드 를 가하 여 0 ℃ 에서 10 분 간 방치 한 후 , 액체 질소 를 사용 하 여 - 80 ℃ 에서 보존 해 둔 것 ) 200 ㎕ 를 , 상기 라 이게 이 션 산물 10 ㎕ 에 가하 여 , 0 ℃ 에서 30 분 방치 했 다 . 계속 해서 , 상기 컴 피턴 트 셀 에 42 ℃ 에서 30 초간 열 쇼크 를 주 고 , 0 ℃ 에서 2 분 간 냉각 했 다 . 그 후 , SOC 배지 ( 20 mM 글루코스 , 2 % 박토 트립 톤 , 0 . 5 % 박토 이스트 추출물 , 10 mM NaCl , 2 . 5 mM KCl , 1 mM MgSO 4 , 1 mM MgCl 2 ) 를 1 ㎖ 첨가 하 여 , 37 ℃ 에서 1 시간 진탕 배양 했 다 . 배양 후 의 배양액 을 각 200 ㎕ 씩 , LB Amp 한 천 배지 ( 암피실린 100 mg / L , 1 . 5 % 한천 을 함유 하 는 LB 배지 ) 에 도포 하 여 , 37 ℃ 에서 하룻밤 배양 했 다 . 한 천 배지 상 에 생육 한 형질전환 체 콜로니 복수 개 를 , 1 . 5 ㎖ 의 LB Amp 배지 ( 암피실린 100 mg / L 를 함유 하 는 LB 배지 ) 에서 37 ℃ 로 하룻밤 배양 했 다 . 얻 어 진 배양액 을 각각 집 균 후 , Flexi Prep ( GE 헬스 케 어 바이오 사이언스 ) 을 사용 하 여 재조합 플라스미드 를 회수 했 다 . 캐 필러 리 DNA 시 퀀서 CEQ 2000 ( 베크만 ? 코울터 ) 을 사용 하 여 , 첨부 된 메뉴 얼 에 따라 , 3 종 의 플라스미드 중 에 클로닝 되 어 있 는 PCR 증폭 산물 의 염기 서열 을 해석 하 여 , PCR 반응 에서 의 에러 변이 가 생기 지 않 은 것 을 확인 했 다 . 계열 1 의 PCR 증폭 산물 유래 DNA 단편 이 클로닝 된 플라스미드 를 pSTK 001 로 , 계열 2 의 PCR 증폭 유래 DNA 단편 이 클로닝 된 플라스미드 를 pSTK 002 로 , 계열 3 의 PCR 증폭 산물 유래 DNA 단편 이 클로닝 된 플라스미드 를 pSTK 003 으로 명명 하 고 , 또한 그 들 플라스미드 를 포함 하 는 대장균 JM 109 주 형질전환 체 를 JM 109 / pSTK 001 , JM 109 / pSTK 002 및 JM 109 / pSTK 003 으로 각각 명명 했 다 .