상기 실험 예 1 내지 4 를 통해 확인 한 단백질 발현 변이 를 검증 하 기 위하 여 웨스턴 블랏 분석 을 실시 하 였 다 . HUVEC 을 1 시간 동안 혈청 이 없 는 배지 에서 안 지 오 제닌 1 ㎍/㎖ 과 함께 배양 하 고 단백질 추출물 을 제조 하 였 다 . 그 후 , HUVEC 용해 물 로부터 단백질 을 NuPAGE ™( Invitrogen 사 , 미국 ) 상 에서 분리 시켰 다 . 총 단백질 을 인산 완충액 으로 세척 하 고 용해 완충액 ( 50 mM Tris - Cl ( pH 7 . 5 ) , EGTA 3 mM , 0 . 5 % 트리톤 X - 100 , β - 글리세 로 포스 페이트 12 mM , 염화 나트륨 150 mM , 플루오르화 나트륨 50 mM , 나트륨 바나 데이트 1 mM , DTT ( dithiothreitol ) 2 mM , 플루오르화 페닐 메틸 설포닐 1 mM , 아 프로 티 닌 ( aprotinin ) 0 . 5 ㎍/㎖, 0 . 1 % β - 머 캅 토 에탄올 및 1 X 프로테아제 억제제 의 혼합물 ) 으로 용해 시켰 다 . 상기 용해질 의 단백질 농도 를 측정 하 고 NuPAGE ™ 4 ~ 12 % Bis - Tris 겔 상 에서 분리 하 였 다 . 그 후 , 상기 전기영동 된 단백질 은 PVDF 막 위 로 옮겨졌 다 . PBST 용액 으로 1 시간 동안 막 을 블로킹 한 후 , 일 차 항체 로 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 배양 하 였 다 . 상기 막 들 을 PBST 용액 으로 세척 하 였 고 , 실온 에서 2 시간 동안 HRP ( horseradish peroxidase ) 와 결합 된 2 차 항체 ( anti - IgG ) 와 배양 하 였 다 .