pTrcKudzu ( 실시 예 1 에서 기재 된 ) 의 bla 유전자 를 카나마이신 내성 을 부여 하 는 유전자 로 대체 하 였 다 . bla 유전자 를 제거 하 기 위해 pTrcKudzu 를 BspHI 로 소화 시키 고 , 쉬 림프 알칼리 포스파타아제 ( SAP ) 로 처리 하 고 65 ℃ 에서 열 사 멸 시킨 후 , Klenow 절편 및 dNTP 로 말단 을 채웠 다 ( end - filled ) . 5 kbp 크기 절편 을 아가로오스 겔 에서 정제 하 고 , 프라이머 MCM 22 5 '- G A T CAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG ( SEQ ID NO : 14 ) 및 MCM 23 5 '- G A T C C G A T CGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC ( SEQ ID NO : 15 ) 를 사용 하 여 pCR - Blunt - II - TOPO 로부터 PCR 증폭 된 kanr 유전자 에 라 이게 이 션 하 고 , HindIII 및 PvuI 으로 소화 시키 고 , 말단 을 채웠 다 . 카나마이신 내성 을 부여 하 는 플라스미드 를 수반 하 는 형질전환 체 ( pTrcKudzuKan ) 를 카나마이신 50 ㎍/㎖ 함유 LA 상 에서 선별 하 였 다 .