SK - N - MC 를 차가운 인산 완충 식염수 ( PBS ; Hyclone , # SH 30256 ) 로 씻 어 내 고 단백질 분해 효소 및 인산 분해 효소 저해제 칵테일 ( 100 X ) 를 가지 는 1 ml 의 용해 완충액 ( 멸 균수 내 10 mM EDTA , 500 mM Na 2 CO 3 , pH 11 ) 으로 긁어내 었 다 . 용해 물 을 초음파 발생 장치 ( Branson Sonicator 250 , Branson Ultrasonic Corp , Danbur , CT , USA ) 를 이용 하 여 균질 화 하 였 고 , 얼음 에서 30 분 동안 볼 텍 싱 하 면서 배양 하 였 다 . 5 - 45 % 불 연속 적 구배 를 형성 하 기 위하 여 , MES - 완충액 [ MBS : 25 mM MES ( pH 65 ) , 0 . 15 M NaCl ] 에 용해 된 4 ml 의 45 % 수크로오스 및 4 ml 의 5 % 수크로오스 를 초 원심 분리 튜브 ( Beckman Coulter , Fullerton , CA , USA ) 에 순차 적 으로 두 었 다 . 그 다음 , 동일 한 양 의 단백질 을 4 ml 의 5 % 수크로오스 를 형성 하 기 위해 조절 하 였 고 , 초 원심 분리 튜브 에 첨가 하 였 다 . 샘플 튜브 를 SW 41 로터 ( Beckman Coulter ) 에서 40 , 000 rpm 으로 24 시간 동안 원심 분리 하 였 다 . 분할 된 샘플 을 획득 하 여 웨스턴 블롯 으로 분석 하 였 다 .