모노클 로 날 Ab ( 1 μ g / 106 cells ) 를 37 ℃ 에서 세포 에 첨가 하 였 다 . 20 분 배양 후 , 세포 를 펠 렛 팅 하 고 MES - 완충 염수 ( 25 mM MES , pH 6 . 5 , 150 mM NaCl , 1 mM 페닐 메틸 설포닐 플 루오 라이드 , 5 μ g / ml 아프 로티 닌 , 5 μ g / ml 루 펩 틴 , 10 mM EDTA ) 내 의 아이스 - 콜드 1 . 0 % 트리톤 X - 100 에서 용해 하 였 다 . 그 다음 , 리 피드 래프트 분획 을 수 크로즈 밀도 구배 원심 분리 에 의해 제조 하 였 다 . 간략히 , 용해 물 을 동등 한 부피 의 용해 버퍼 내 의 80 % 수 크로즈 와 혼합 하 고 , 비 연속 5 - 30 % 수 크로즈 밀도 구배 로 오버레이 한 다음 , 200 , 000 x g 에서 16 시간 원심 분리 하 였 다 . 분획 ( 0 . 5 ml ) 을 수집 하 고 , 웨스턴 블롯 팅 으로 분석 하 였 다 . 각 분획 의 15 ml 분액 을 2 x 로딩 버퍼 에 1 : 1 로 희석 하 고 , 95 ℃ 에서 5 분 간 가열 하 고 , 15 % SDS - PAGE 겔 에서 분리 하 고 , PVDF 멤 브레인 상 에 옮기 고 , 일 차 항체 ( 예 , 항 - CD 20 , CD 20 을 검출 하 기 위한 클론 7 D 1 또는 래프트 분획 을 식별 하 기 위한 항 - Lyn 토끼 다 혈청 ; Serotec , UK ) 와 함께 배양 한 다음 , HRP - 컨 주 게 이티 드 2 차 항체 ( Amersham Biosciences UK Ltd ) ) 와 함께 배양 하 였 다 . 블롯 은 ECL + plus ( Amersham Biosciences UK Ltd ) 를 이용 하 여 가시 화 되 었 다 .