RNAi 기술 을 도입 하 기 위하 여 목표 PMT 유전자 의 절편 이 반대 방향 으로 반복 되 게 클로닝 된 핵산 서열 을 제조 할 필요 가 있 다 . PMT 타입 에 따라 영향 을 받 지 않 도록 하 기 위하 여 버어 리 종 PMT 유전자 와 잔 티 종의 PMT 1 , 2 , 3 , 및 4 유전자 의 공통부분 ( 서열 번호 4 ) 을 탐색 한 후 이 를 기초 로 PCR 을 통해 클로닝 하 기 위한 프라이머 를 선정 하 였 다 ( 아래 서열 번호 4 에서 밑줄 친 부분 및 서열 번호 1 내지 3 참조 ) . 서열 번호 1 , 2 , 3 의 양 끝 에 SacI , XbaI 및 BamHI 등 제한 효소 인식 부위 를 삽입 하 여 목표 유 전자 를 역방향 으로 반복 하 여 클로닝 하 기 용이 하 도록 설계 하 였으며 , 이 프라이머 와 공통부분 을 주형 으로 한 PCR 을 수행 하 여 목표 유전자 를 증폭 하 였 다 . 전기영동 을 통해 크기 가 확인 된 유전자 절편 은 pGEM - T easy vectorTM 내 에 삽입 하 고 삽입 여부 를 제한 효소 로 처리 하 여 확인 한 뒤 , 염기 서열 을 분석 하 여 유전자 를 확인 하 였 다 ( 도 1 , 도 2 ) . 서열 번호 1 과 3 을 프라이머 의 부분 으로 이용 하 여 증폭 한 PMT 목표 유전자 ( 서열 번호 11 ) 와 서열 번호 2 와 3 을 프라이머 의 부분 으로 이용 하 여 증폭 한 PMT 목표 유전자 사이 ( 서열 번호 12 ) 에 스 페이서 유전자 를 삽입 하 여 RNAi 용 재조합 뉴클레오타이드 를 제조 하 였 다 . 상기 목표 유전자 들 은 도 12 에서 나타낸 바 와 같이 노란색 으로 표시 되 어 있 는 cccaaaaa 에서 agtatgatcgagt 까지 의 서열 ( 서열 번호 11 ) 과 aaatgctt 에서 agtatgatcgagt 까지 의 서열 ( 서열 번호 12 ) 로 나타낼 수 있 고 , 이 들 은 재조합 벡터 내 에 역반 복 적 으로 도입 된다 .