23 신호 펩티드 가 결여 된 , 인간 콜라겐 IX 의 NC 4 의 유전자 를 , 전술 된 방법 ( Pihlajama T , et al . Characterization of Recombinant Amino - terminal NC 4 Domain of Human Collagen IX : Interaction with glycosaminoglycans and cartilage oligomeric matrix protein . J . Biol . Chem . 2004 ; 279 : 24265 - 24273 ) 을 기초 로 , GST 융합 태그 에 대한 서열 과 플레임 에 맞 게 ( in - frame ) pGAT - 2 박테리아 발현 벡터 상 에 구축 하 였 다 . 재조합 인간 NC 4 ( rhNC 4 ) 구 조체 를 대장균 ( Escherichia coli ) BL 21 ( DE 3 ) 세포주 내 로 전이 시켰 다 . 100 μ / ml 암피실린 이 보충 된 원 하 는 최종 부피 의 LB 매질 에 , 세포주 ( 1 : 100 ) 를 접종 시켜 , 융합 단백질 을 교반 플라스크 에서 발현 시켰 다 . 세포 는 600 nm 에서 의 흡광도 가 0 . 6 에 이 를 때 까지 , 37 ℃ 에서 성장 시켰 다 . 이소프로필 - 베타 - D - 티 오갈 락 토피 라 노 사이드 ( IPTG ) 의 추가 로 발현 을 유도 하 여 , 최종 농도 가 0 . 5 mM 가 되 도록 하 였 다 . 4 - 6 시간 또는 16 시간 동안 37 ℃ 에서 배양 을 지속 하 였 다 . 원심 분리 후 , 세포 펠 렛 을 3 회 1 xPBS 로 세척 하 고 균질 화 ( homogenisation ) 완충액 [ 0 . 3 M NaCl , 0 . 2 % IGEPAL CA - 630 ( Sigma , Sydney , Australia ) , 0 . 05 M 인산염 나트륨 완충액 ( pH 7 ) , 0 . 25 mg / ml 라이소자임 ] 으로 재 부유 시킨 후 , 냉동 보관 하 고 , 초음파 로 얼음 상 에 균질 화 하 였 다 . 40 분 간 4 ℃ 에서 17 , 000 g 으로 원심 분리 하 여 , 불용성 물질 을 제거 하 였 다 . 융합 단백질 은 암모늄 설 페이트 를 가하 여 , 30 % 포화 시켜 , 상청 액 으로부터 침전 시켰 다 . 침전물 은 30 분 간 4 ℃ 에서 23 , 000 g 로 원심 분리 하 여 수집 하 고 , 1 x PBS ( 1 % IGEPAL - CA 630 함유 ) 에 용해 시켰 다 . 용액 을 30 분 간 4 ℃ 에서 23 , 000 g 로 원심 분리 하 여 청정 화 하 고 , 4 ℃ 에서 250 ml / 분 유속 으로 글 루타 치 온 - 세파 로스 4 FF ( Amersham Biosciences , Sydney , Australia ) 컬럼 에 적용 하 였 다 . 내독소 를 제거 하 기 위하 여 , 1 x PBS ( 0 . 1 % 트리톤 X - 114 함유 ) 50 컬럼 부피 ( CV ) 를 적용 하 여 비 결합 물질 을 제거 하 고 , 1 x PBS ( 멸균 ) 의 20 CV 로 세척 하 였 다 ( Reichelt P , Schwarz C and Donzeau M . Single step protocol to purify 재조합 proteins with low endotoxin contents . Protein Expression and Purification 46 : 483 - 488 , 2006 ) . 인자 Xa 절단 완충액 ( 멸균 ) 10 CV 로 평형 화 한 후 , 실온 에서 인자 Xa 단 백 분 해 효소 ( Amersham Biosciences 또는 Promega ) 로 밤새 소화 시켜 , 융합 GST 로부터 재조합 NC 4 ( rNC 4 ) 를 절단 하 였 다 . 벤즈 아미딘 세파 로스 4 FF 결합 완충액 ( 50 mM Tris - HCl , 100 mM NaCl , pH 7 . 4 ) 의 용출 액 을 이용 하 여 , rhNC 4 용액 을 글 루타 치 온 - 세파 로스 컬럼 을 통하 여 이동 시키 고 , 벤즈 아미딘 세파 로스 4 FF 컬럼 ( Amersham Biosciences ) 을 이용 하 여 추가 정제 시켰 다 . 용출 되 서 나온 ( flow - through ) rhNC 4 는 농축 시키 고 , 5 K 컷오프 ( cut - off ) 농축기 ( Agilent Technologies ) 에서 dH 2 O 로 세척 하 여 탈염 하 였 다 . 슈퍼 덱스 ( Superdex ) S - 200 컬럼 을 이용 하 여 , 크기 배제 크로마토그래피 로 최종 정제 를 수행 하 였 다 . 생성물 의 크기 및 순도 는 SDS - PAGE 분석 및 웨스턴 블랏팅 에 의해 정량 되 었 다 . 정제 된 rhNC 4 의 농도 는 브래드포드 ( Bradford ) ( Sigma , Sydney , Australia ) 또는 BCA 단백질 분석법 에 의해 측정 되 었 다 .