다음 으로 칼슘 이온 통로 α 1 B -/- 유전자 의 유전자형 을 갖 고 있 는 본 발명 의 유전자 변이 유전자 변이 생쥐 에서 실제 적 으로 칼슘 이온 통로 α 1 B 유전자 가 발현 되 지 않 음 을 확인 하 기 위하 여 웨스턴 블 럿 분석 ( western blot analysis ) 을 수행 하 였 다 . 구체 적 으로 , 정상 생쥐 와 동 형 접합체 유전자 변이 생쥐 를 경추 탈 골법 으로 희생 시킨 후 두개골 을 절개 하 여 대뇌 ( cerebrum ) 를 분리 하 였 다 . 분리 된 대뇌 조직 을 단백질 분해 억제제 가 포함 된 용해액 ( 50 mM Tris ( pH 7 . 4 ) , 1 mM EGTA , 1 mM DTT 및 1 mM PMSF , 단백질 분해 억제 혼합액 ( Boehringer Mannheim ) , 칼 페인 억제제 I 과 Ⅱ ) 에 넣 어 분쇄 하 였 다 . 상기 조직액 을 1 , 000 rpm 으로 5 분 동안 원심 분리 하 여 상층 액 과 침점 물 을 분리 한 후 상층 액 만 을 취하 여 다시 28 , 000 rpm 으로 15 분 동안 원심 분리 하 여서 대략 의 세포막 단백질 을 얻 었 다 . 상기 세포막 단백질 을 8 ~ 16 % 아크릴아미드 겔 에 전기영동 하 고 니트 로 셀 룰 로즈 막 ( nitrocellulose membrane , PROTRAN , Schleicher & Schuell 사 ) 에 트랜스퍼 하 였 다 . 상기 니트로셀룰로오스 막 에 5 % 탈지유 가 포함 된 TTBS 완충액 ( 10 mM Tris 완충 용액 ( pH 7 . 5 ) , 150 mM 염화나트륨 , 0 . 05 % tween 20 ) 을 처리 하 였 다 . 이어서 칼슘 이온 통로 α 1 B 에 대한 단일 항체 α 1 B ( CW 21 , Vance et al . , J . Biol . Chem . , 1998 , 273 , 14495 - 502 ) 를 처리 하 여 하이브리드 반응 을 수행 하 였 다 . 칼슘 이온 통로 α 1 B 단백질 에 결합 한 단일 항체 를 검출 하 기 위하 여 퍼 옥시 다제 ( peroxidase ) 가 결합 된 항 - 생쥐 IgG 항체 를 첨가 한 후 ECL 키트 ( Amersham 사 ) 를 기질 로 사용 하 여 발색 반응 을 시켰 다 .