구체 적 으로 , 상기 흑색종 마우스 모델 에서 종양 조직 을 적출 한 뒤 , 2 ml 의 PBS ( 2 % 의 FBS 포함 ) 가 담겨 있 는 6 웰 플레이트 에 상기 적출 된 종양 조직 을 넣 고 e - 튜브 를 이용 하 여 잘 게 갈 았 다 . 이때 , 종양 조직 의 크기 가 너무 클 경우 에 는 가위 를 이용 하 여 1 차 절단 을 하 였 다 . 상기 잘 게 갈린 종양 조직 과 , e - 튜브 의 벽 에 붙 어 있 는 모든 조직 을 스 트레이너 ( strainer ) 를 통해 걸러 50 ml 튜브 에 넣 은 뒤 , 최종 볼륨 을 20 ml 로 맞추 어 4 도씨 에서 2000 rpm 으로 10 분 동안 원심 분리 하 였 다 . 이후 , 석 션 을 통해 상층 액 을 제거 하 고 , 3 ml 의 RBC 용해 버퍼 ( lysis buffer ) 를 넣 고 상온 에서 30 초 동안 반응 시킨 뒤 , 2 % 의 RPMI 를 넣 어 비활성 화 시켰 다 . 그런 다음 , 원심 분리 를 수행 하 고 상층 액 을 제거 한 뒤 에 , 스 트레이너 를 이용 하 여 재 현 탁 된 펠 렛 을 거른 뒤 원심 분리 를 수행 하 였 다 . 이후 , 8 ml 의 붉은색 의 44 % 퍼 콜 ( percoll , percoll : RPMI = 11 : 14 ) 을 이용 하 여 재 현 탁 된 펠 렛 을 15 ml 튜브 로 옮기 고 , 5 ml 의 깨끗 한 67 % 퍼 콜 ( percoll : PBS = 67 : 33 ) 을 파스 테르 파이 펫 을 이용 하 여 천천히 상기 15 ml 튜브 의 아래층 에 넣 었 다 . 상기 15 ml 튜브 를 4 도씨 2000 rpm 에서 20 분 동안 브레이크 가 걸리 지 않 는 조건 의 원심 분리 를 수행 하 고 , 버피 코트 ( buffy coat ) 위 약 1 ml 까지 제거 한 뒤 에 , 버피 코트 를 분리 하 여 15 ml 튜브 에 옮겨 담 았 다 . 이후 , 버피 코트 가 포함 된 15 ml 튜브 에 2 % 의 FBS 가 포함 된 PBS 를 이용 하 여 재 현 탁 시킨 뒤 에 종양 침윤 림프구 의 세포 수 를 측정 하 였 다 .