avi - 태그 및 6 xhis - 태그 의 상류 에 클로닝 된 에스 케 리키아 콜라 이 - 발현 된 인간 TNC A 2 에 대한 선별 을 수행 하 였 다 ( 서열 번호 97 참조 ) . 항원 은 발현 시 생체 내 에서 바 이오티 닐 화 되 었 다 . 100 nM 부터 2 nM 까지 감소 하 는 농도 의 인간 TNC A 2 를 사용 하 여 일차 TNC A 2 선별 에 대해 기재 된 바 와 같이 용액 중 에서 선별 을 수행 하 였 다 . 친화 성숙 된 클론 을 ELISA 로 확인 한 후 , 프로테 온 ( ProteOn ) XPR 36 바이오센서 ( 바이오 라드 ) 를 이용 하 여 이 차 스크리닝 을 수행 하 고 , 친화 정제 된 Fab 제제 를 동일 한 기계 에서 분석 하 여 반응 속도 상수 및 친화성 을 측정 하 였 다 . NLC 센서 칩 ( 바이오 라드 ) 상 에 고정 된 항원 과 함께 프로테 온 XPR 36 기계 ( 바이오 라드 ) 를 25 ℃ 에서 이용 하 여 표면 플라스몬 공명 으로 KD 를 측정 하 였 다 . 요약 하 건대 , 재조합 항원 을 PBS / 0 . 005 % 트윈 - 20 ( pH 7 . 4 ) 으로 10 ㎍/㎖ 까지 희석 하 고 100 초 내지 300 초 동안 30 ㎍/ 분 의 속도 로 주입 하 여 약 200 내지 800 반응 유닛 ( RU ) 의 커플링 된 항원 을 달성 하 였 다 . 1 - 샷 ( shot ) 동역학 적 측정 을 위해 , 정제 된 Fab 의 2 배 연속 희석 물 ( 약 0 . 01 nM 내지 25 nM 의 농도 범위 ) 을 100 ㎕/ 분 의 유속 으로 주입 하 였 다 . 결합 시간 은 210 초 이 었 고 , 해리 시간 은 600 초 이 었 다 . 50 mM NaOH 를 100 ㎕/ 분 의 유속 으로 18 초 동안 주입 하 여 센서 칩 을 재생 시켰 다 . 결합 및 해리 센서 그램 을 동시 에 피팅 함 으로써 단순 1 - 대 - 1 랭뮤어 결합 모델 ( 프로테 온 매니저 소프트웨어 버전 2 . 1 ) 을 이용 하 여 결합 속도 ( kon ) 및 해리 속도 ( koff ) 를 계산 하 였 다 . 평형 해리 상수 ( KD ) 를 비 koff / kon 로서 계산 하 였 다 .