충돌 제트 공정 에 의해 지질 나노 입자 를 제조 하 였 다 . 알콜 중 에 용해 되 어 있 는 지질 을 시트 레이트 완충제 중 에 용해 되 어 있 는 siNA 와 혼합 함 으로써 입자 를 형성 하 였 다 . 지질 대 siNA 의 혼합 비율 은 45 - 55 % 지질 대 65 - 45 % siNA 로 표적 화 하 였 다 . 지질 용액 은 알콜 ( 예 를 들 어 , 에탄올 ) 중 5 - 15 mg / mL 의 농도 로 , 9 - 12 mg / mL 를 표적 으로 하 여 양 이온 성 지질 , 헬퍼 지질 ( 콜레스테롤 ) , PEG ( 예컨대 , PEG - C - DMA , PEG - DMG ) 지질 , 및 DSPC 를 함유 하 였 다 . 지질 의 비율 은 양 이온 성 지질 의 경우 , 범위 가 25 - 98 몰 % 이 고 , 35 - 65 몰 % 를 표적 으로 하 며 , 헬퍼 지질 의 경우 , 범위 가 0 - 75 몰 % 이 고 , 30 - 50 몰 % 를 표적 으로 하 며 , PEG 지질 의 경우 , 범위 가 1 - 15 몰 % 이 고 , 1 - 6 몰 % 를 표적 으로 하 며 , DSPC 의 경우 , 범위 가 0 - 15 몰 % 이 고 , 0 - 12 몰 % 를 표적 으로 하 였 다 . siNA 용액 은 pH 범위 가 3 . 5 - 5 인 시트르산 나트륨 완충 된 염 용액 중 0 . 3 내지 1 . 0 mg / mL 범위 의 농도 로 , 0 . 3 - 0 . 9 mg / mL 를 표적 으로 하 여 하나 이상 의 siNA 서열 을 함유 하 였 다 . 두 액체 를 15 - 40 ℃ 범위 의 , 30 - 40 ℃ 로 표적 화 된 온도 로 가열 한 후 , 충돌 제트 혼합기 에서 혼합 하 였을 때 , 그 즉시 LNP 가 형성 되 었 다 . teeID 범위 는 0 . 25 내지 1 . 0 mm 이 고 , 총 유량 은 10 - 600 mL / 분 이 었 다 . 유량 과 배관 ID 의 조합 이 LNP 의 입자 크기 를 30 내지 200 nm 으로 조절 하 는 효과 를 가지 고 있 었 다 . 이어서 , 혼합 비율 을 1 : 1 내지 1 : 3 vol : vol 범위 로 , 1 : 2 vol : vol 을 표적 으로 하 여 높 은 pH 의 완충 된 용액 과 함께 상기 용액 을 혼합 하 였 다 . 상기 완충 된 용액 의 온도 는 15 - 40 ℃ 범위 의 온도 였으며 , 30 - 40 ℃ 를 표적 으로 하 였 다 . 음 이온 교환 여과 단계 를 수행 하 기 30 분 내지 2 hr 전 에 혼합 된 LNP 를 유지 시켰 다 . 인 큐 베이 션 을 진행 하 는 동안 의 온도 는 15 - 40 ℃ 범위 의 온도 였으며 , 30 - 40 ℃ 를 표적 으로 하 였 다 . 인 큐 베이 션 후 , 음 이온 교환 분리 단계 를 포함 하 여 , 0 . 8 um 필터 를 통해 용액 을 여과 시켰 다 . 상기 공정 에서 는 배관 ID 범위 가 1 mm ID 내지 5 mm ID 이 고 , 유량 이 10 내지 2 , 000 mL / 분 인 것 을 사용 하 였 다 . LNP 를 농축 시키 고 , 한외 여과 공정 을 통해 정용 여과 하 여 알콜 을 제거 하 고 , 시트 레이트 완충제 를 최종 완충제 용액 , 예컨대 , 포스 페이트 완충 된 염수 로 교환 하 였 다 . 한외 여과 공정 은 접선 흐름 여과 포맷 ( TFF ) 을 사용 하 였 다 . 상기 공정 은 막 의 공칭 분자량 컷오프 범위 가 30 - 500 KD 인 것 을 사용 하 였 다 . 막 포맷 은 중공 섬유 또는 플랫 시트 카세트 였 다 . 적절 한 분자량 컷오프 를 사용 한 TFF 공정 은 보유 액 주 에서 는 LNP 를 보유 하 였 고 , 여과 물 또는 침투 물 은 알콜 ; 시트 레이트 완충제 ; 최종 완충제 폐기물 을 함유 하 였 다 . TFF 공정 은 초기 에 siNA 농도 를 1 - 3 mg / mL 로 농축 시키 는 , 다 단계 공정 이 었 다 . 농축 후 , LNP 용액 을 10 - 20 부피 에 대해서 최종 완충제 에 대해 정용 여과 하 여 알콜 을 제거 하 고 , 완충제 교환 을 수행 하 였 다 . 이어서 , 물질 을 추가 로 1 - 3 배 농축 시켰 다 . LNP 공정 의 최종 단계 는 농축 된 LNP 용액 을 멸균 여과 하 고 , 생성물 을 바이알 에 넣 는 것 이 었 다 .