MCF - 7 세포 를 통상 적 으로 맥코이 5 a , 10 % FCS , 1 . 5 mM L - 글루타민 중 DMEM / F 12 , 15 mM HEPES , L - 글루타민 , 10 % FCS 및 SK - Br - 3 에서 유지 하 였 다 . 완전 배지 에서 성장 시킨 준 - 전면 성장 MCF 7 또는 SK - Br - 3 세포 를 아쿠 타제 ( PAA 래 보 러 토리 즈 ( PAA Laboratories ) ) 로 수확 하 고 , 적절 한 성장 배지 에 5 x 105 개 세포 / mL 의 최종 농도 에 재현 탁 시켰 다 . 이어서 , 100 μ L 의 세포 현탁액 을 96 - 웰 편평 바닥 플레이트 ( 눈 크 ) 의 각각 의 웰 에 첨가 하 여 5 x 104 개 세포 / 웰 의 최종 밀도 를 제공 하 였 다 . MCF 7 세포 를 대략 3 시간 동안 부착 시킨 후 에 배지 를 0 . 5 % FBS 를 함유 하 는 고갈 배지 로 교환 하 였 다 . 이어서 , 모든 플레이트 를 37 ℃ 에서 밤새 인 큐 베이 션 한 후 에 적절 한 농도 의 HER 3 항체 ( 적절 한 배지 에 희석 됨 ) 로 80 분 동안 37 ℃ 에서 처리 하 였 다 . MCF 7 세포 를 최종 20 분 동안 50 ng / mL 뉴 레 귤 린 1 - β 1 EGF 도메인 ( R & D 시스템즈 ) 으로 처리 하 여 HER 3 인산화 를 자극 하 였 다 . 모든 배지 를 부드럽 게 흡인 하 고 , 세포 를 1 mM CaCl 2 및 0 . 5 mM MgCl 2 ( 깁 코 ( Gibco ) ) 를 함유 하 는 빙 냉 PBS 로 세척 하 였 다 . 50 μ L 빙 냉 용해 완충제 ( 20 mM 트리스 ( pH 8 . 0 ) / 137 mM NaCl / 10 % 글리세롤 / 2 mM EDTA / 1 % NP - 40 / 1 mM 나트륨 오르토 바나 데이트 / 아 프로 티 닌 ( 10 μ g / mL ) / 류 펩 틴 ( 10 μ g / mL ) ) 를 첨가 하 여 세포 를 용해 시키 고 , 얼음 상 에서 30 분 동안 진탕 시키 면서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 용해 물 을 수집 하 고 , 1800 g 에서 15 분 동안 4 ℃ 에서 회전 시켜 세포 잔해 를 제거 하 였 다 . 20 μ L 의 용해 물 을 미리 - 제조 된 포획 플레이트 에 첨가 하 였 다 .