96 웰 플레이트 ( Pierce , Cat # 15041 ) 를 4 C 에서 하룻밤 동안 0 . 1 M 탄산염 ( pH 9 . 5 ) 중 1 . 0 ㎍/ ml Her 2 - hFc ( 플레이트 # 1 ) ( Acrobiosystems , Cat # HE 2 - H 5253 ) 또는 FMC 63 ( 플레이트 # 2 ) ( NOVUS , Cat # NBP 2 - 527160 ) 로 코팅 하 였 다 . 플레이트 를 실온 에서 1 시간 동안 TBS 중 0 . 3 % 탈지 우유 ( 200 ㎕/ 웰 ) 로 차단 하 였 다 . 세 척 완충액 ( 1 x TBST : 0 . 1 M Tris , 0 . 5 M NaCl , 0 . 05 % Tween 20 ) 으로 3 회 세척 하 였 다 . 세포 배양 상등 액 은 무 희석 부터 3 배 희석 물 까지 적정 하 였으며 ; 정제 된 구축물 # 42 단백질 ( LakePharma ) 은 1 ㎍/ ml 로 시작 하 여 3 배 희석 물 까지 낮추 었 다 . 다음 으로 , 웰 당 100 ㎕ 를 첨가 하 고 , 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 희석 완충액 은 1 x TBS ( 0 . 1 M Tris , 0 . 5 M NaCl ) 중 1 % BSA 이 다 . 플레이트 를 세척 완충액 으로 3 회 세척 하 였 다 . 플레이트 # 1 의 경우 , 100 ㎕ 의 1 ㎍/ ml FMC 63 을 실온 에서 1 시간 동안 각각 의 웰 에 첨가 한 후 , 1 : 2000 의 100 ㎕ HRP - 항 - mIgG 를 첨가 하 였 다 . 플레이트 # 2 의 경우 , 웰 당 1 : 2000 의 100 ㎕ HRP - 항 - his 를 적용 하 고 , 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 최종 단계 를 위하 여 , Thermo Fisher 의 1 - Step Ultra TMB - ELISA ( Prod # 34028 ) 를 웰 당 100 ㎕ 로 첨가 하 고 , 색상 이 전개 되 었 을 때 플레이트 를 405 nm 에서 판독 하 였 다 .