라운드 2 포화 돌연변이 유발 라이브러리 로부터 의 88 개 의 변이체 를 다음 과 같이 스크리닝 하 였 다 : 100 μ L 반응 에서 25 μ L 용해 물 의 용해 물 로딩 을 사용 하 고 1 mM 스테비오 시드 I ( 실시 예 10 에서 설명 된 바 와 같이 레바 우디 오시드 A 로부터 제조 됨 ) 의 기질 로딩 및 1 mM UDP - 글루코스 ( Sigma , > 98 % 순도 ) 의 보조 기질 로딩 을 사용 하 여 서열 번호 769 변이체 를 발현 하 는 맑 아 진 이 . 콜라 이 배양액 용해 물 의 96 웰 플레이트 상 에서 검정 을 수행 하 였 다 . 하 기 반응 조건 을 사용 하 였 다 : 66 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 적정 플레이트 진탕기 에서 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 7 . 3 , 3 mM MgCl 2 , 40 ℃. 반응물 을 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 90 μ L 아세 토니 트릴 에 10 μ L 의 반응물 을 첨가 함 으로써 켄 칭 하 고 , 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 표 15 . 5 에 기재 된 기기 및 파라미터 를 사용 하 여 글 리코 실화 된 생성물 을 물 에 1 : 10 으로 희석 한 후 , LC - MS / MS 에 의해 상청 액 에서 검출 하 였 다 . 서열 번호 770 보다 더 많 은 양 으로 레바 우디 오시드 I 로부터 레바 우디 오시드 M 을 생성 한 글 리코 실트 랜스 퍼라 제 변이체 폴리펩티드 가 확인 되 었 다 . 상위 2 개 의 조작 된 폴리펩티드 는 서열 번호 1292 및 1294 이 며 , 이 들 은 각각 서열 번호 770 과 비교 하 여 돌연변이 F 156 R 및 G 199 H 를 갖 는다 .