포유 동물 세포 에서 의 SpCas 9 의 발현 을 위해 , 본 발명자 들 은 sgRNA 코딩 카세트 가 제거 된 pX 330 - U 6 - 키메라 _ BB - CBh - hSpCas 9 ( 애드 진 으로부터 얻 음 , # 42230 ) ( Cong L et al . , Science . 2013 , 339 ( 6121 ) : 819 - 23 ) 유래 된 플라스미드 , pX - Cas 9 를 채용 하 였 다 . SpCas 9 코딩 서열 은 인간 코돈 최적 화 되 었 으며 , CBh 프로모터 에 의해 조절 된다 . 또한 , 핵 유입 을 허용 하 기 위해 2 개 의 핵 국재 화 신호 ( NLS ) 가 SpCas 9 의 N - 및 C - 말단 에 첨가 되 었 으며 , 삼중 FLAG 는 검출 을 용이 하 게 하 기 위해 단백질 의 N - 말단 단부 에 위치 된다 . 개선 된 Cas 9 변이체 를 코딩 하 는 플라스미드 를 pX - Cas 9 플라스미드 로부터 시작 하 여 순차 적 부위 지정 돌연변이 유발 에 의해 얻 었 다 . 이전 에 공개 된 향상 된 SpCas 9 돌연변이체 의 발현 을 위해 , VP 12 ( 애드 진 으로부터 얻 음 , # 72247 ) ( Kleinstiver BP et al . , Nature . 2016 , 529 ( 7587 ) : 490 - 5 ) 및 eSpCas 9 ( 1 . 1 ) ( 애드 진 으로부터 얻 음 , # 71814 ) ( Slaymaker IM et al . , Science . 2016 , 351 ( 6268 ) : 84 - 8 ) 플라스미드 를 사용 하 였 다 . 목적 하 는 스 페이서 서열 을 U 6 프로모터 - 유래 된 발현 카세트 를 함유 하 는 pUC 19 플라스미드 의 가이드 RNA 불변 부분 의 상류 의 이중 BbsI 부위 내 로 적절 한 오버행 을 갖 는 어닐링 된 올리 고 뉴클레오티드 로서 클로닝 하 였 다 . 렌 티 바이러스 벡터 를 수반 한 실험 을 위해 , 렌 티 CRISPRv 1 전달 벡터 ( 애드 진 으로부터 얻 음 , # 49535 ) ( Cong L et al . , Science . 2013 , 339 ( 6121 ) : 819 - 23 ) 를 수포성 구내염 바이러스 당단백질 ( VSVG ) 을 코딩 하 는 pCMV - 델타 8 . 91 패킹 벡터 ( 스위스 EPFL 의 디디 어 트 로 노 ( Didier Trono ) 로부터 의 친절 한 수여 품 ) 및 pMD 2 . G ( 애드 진 으로부터 얻 음 , # 12259 ) 와 함께 채용 하 여 , 바이러스 입자 를 생산 하 였 다 . 렌 티 CRISPRv 1 전달 벡터 는 형질 도입 된 세포 의 선택 을 허용 하 는 푸 로 마이신 코딩 서열 에 2 A - 펩티드 를 통해 융합 된 N - 말단 FLAG - 태그 부착 된 SpCas 9 의 코돈 - 인간 화 버전 에 대한 발현 카세트 를 함유 한다 . U 6 - 유래 된 발현 카세트 는 sgRNA 를 전사 한다 . 목적 하 는 스 페이서 에 상응 하 는 어닐링 된 올리고 를 이중 BsmBI 부위 를 사용 하 여 가이드 RNA 내 로 클로닝 하 였 다 . 향상 된 SpCas 9 변이체 를 코딩 하 는 렌 티 CRISPRv 1 - 기반 벡터 를 , SpCas 9 코딩 서열 의 일부 를 돌연변이 를 함유 하 는 CDS 의 영역 에 상응 하 는 PCR 단편 으로 교체 함 으로써 생성 하 였 다 ( 프라이머 에 대해서 는 , 부록 표 2 참조 ) . pTRE - GFP 플라스미드 를 pEGFP - N 1 ( 클론 테크 ( Clontech ) ) 플라스미드 로부터 의 EGFP 코딩 서열 을 pTRE - 타이트 클로닝 벡터 ( 클론 테크 ) 내 로 서브 클로닝 함 으로써 얻 었 다 . 가이드 RNA 타 겟 부위 의 완전 한 목록 은 부록 에서 이용 가능 하 다 . 모든 올리 고 뉴클레오티드 는 유로 핀스 게 노 믹스 ( Eurofins Genomics ) 로부터 구입 하 였 다 .