출발 물질 은 100 - 200 kb 길이 의 살 아 있 는 BAC 클론 물질 ( 10 ) 로 , E . coli 박테리아 세포 의 게놈 에 인간 DNA 서열 이 삽입 된 것 이 다 . 냉동 시킨 BAC 글리세롤 스톡 물질 의 소형 칩 을 입수 하 여 , 이 를 표준 박테리아 세포 배양 프로세스 를 위한 출발 물질 로서 사용 하 였 다 ( 11 ) . 세포 를 선택 항생제 와 함께 37 ℃ 에서 밤새 50 ml 시험 관내 에서 35 ml 배지 중 에 표준 BAC 배양 프로토콜 에 따라 배양 하 였 다 . 그런 후 , 배양 된 세포 를 4 ℃ 에서 20 분 간 원심 분리 하 여 시험관 바닥 으로 가라앉히 고 , 상층 액 을 취하 여 버렸 다 . 세포 펠 렛 을 RNase 가 포함 된 완충액 으로 재현 탁한 다음 , LyseBlue ( Qiagen , Valencia CA ) 및 SDS 로 세포 용혈 하 였 다 . 용혈 물 ( 12 ) 을 약 20 , 000 g 에서 30 분 간 원심 분리 ( 13 ) 하 고 , 용액 에 DNA 에 함유 된 상층 액 을 취하 고 펠 렛 을 버렸 다 . 상층 액 을 대상 으로 원심 분리 를 15 분 간 반복 하 였 다 . 용해 된 BAC DNA 가 함유 된 맑 은 상층 액 을 모우 고 , 세포 찌꺼기 , 단백질 및 그 외 불순물 들 은 시험관 바닥 으로 가라앉힌 후 버렸 다 . BAC DNA 를 상층 액 으로부터 Qiagen Genomic - Tip 20 / G 컬럼 정제 키트 를 이용 하 여 추출 및 정제 ( 17 ) 하 였 다 . 키트 는 정제 컬럼 ( 15 ) 을 포함 하 며 , 이 를 완충액 으로 세정 및 용리 하 였 다 ( 16 ) . 용리 후 , 고도 로 정제 된 BAC DNA 를 이소프로판올 ( 19 ) 침전 에 의해 침전 및 펠 렛 화 하 였 다 . 정제 된 BAC DNA ( 18 ) 의 수율 은 전형 적 으로 20 - 200 ng 이 었 다 . 이 BAC DNA 는 건조 펠 렛 으로 저장 하 거나 또는 다음 단계 에 바로 사용 하 기 위해 물 에 재현 탁 할 수 있 다 .