세포 를 차가운 PBS 로 세척 한 후 , 세포 를 4 ℃ 에서 용해 버퍼 [ 20 mM Tris - HCI ( pH 7 . 5 ) , 15 O mM NaCI , 0 . 5 % NP - 40 , 5 mM EDTA , 프로테아제 억제제 가 첨가 된 1 % triton X - 100 ] 에 넣 고 모았 다 . 수거 한 단백질 시료 들 을 35 ℃ 에서 5 분 동안 가열 하 여 , 100 V 에서 90 분 동안 폴리 비닐리덴 디 플 루오 라이드 ( polyvinylidene difluoride ) 막 에 옮긴 후 , 아크릴아마이드 겔 상 에서 SDS - PAGE 를 수행 하 였 다 . 막 을 0 . 05 %( vol / vol ) 트윈 20 과 5 %( wt / vol ) 무 지방 건조 우유 가 함유 된 Tris - buffered saline ( TBS ) 로 1 시간 동안 차단 한 후 , 4 ℃ 에서 5 % 무 지방 우유 에 적절 한 항체 ( PARP , 1 : 2000 dilution , Caspase - 9 , 1 : 2000 dilution , Bax 1 : 2000 dilution , actin , 1 : 3000 dilution ) 를 넣 고 밤새 도록 배양 하 였 다 . 단백질 - 항체 복합체 가 결합 된 막 을 HRP 가 결합 된 이 차 항체 로 2 시간 동안 배양 한 후 , 증가 된 chemiluminescence kit ( Amersham Biosciences , UK ) 로 현상 시켰 다 . 폴리 ADP - 리보스 중합효소 ( poly ADP - ribose polymerase ; PARP ) 분열 은 세포 사멸 의 중요 한 지표 로써 구축 되 어 있 다 . LY 255283 을 48 시간 동안 처리 한 후 , 세포 사멸 의 유도 가 253 J - BV 세포주 에서 관찰 되 었 다 . 웨스턴 블롯 ( western blot ) 분석 에서 LY 255283 이 pro - caspase 9 의 억제 를 유발 함 이 관찰 되 었 다 . 상기 결과 는 LY 255283 에 의해 유도 된 세포 사멸 이 캐스 페이즈 ( caspase ) 에 의존 적 임 을 나타낸다 . 또한 세포 에 10 μ M LY 255283 을 48 시간 동안 처리 하 였을 경우 , pro - apoptotic 단백질 과 Bax 가 상당히 증가 되 었 다 . 그러나 , 동일 조건 에서 세포 에 U 75302 를 처리 하 는 경우 , 단백질 발현 에 상당 한 변화 가 나타나 지 않 았 다 .