다음 과 같 은 HTP 효소 결합 검정 을 사용 하 여 조합 라이브러리 를 스크리닝 하 였 다 : 펠 렛 화 된 이 . 콜라 이 배 양물 을 1 mM 황산마그네슘 및 0 . 5 mg / mL 리소자임 및 폴리 믹 신 B 술 페이트 ( PMBS ) 와 함께 400 μ L 의 트리스 - HCl , pH 7 . 5 로 용해 시키 고 , 원심 분리 에 의해 맑 게 하 였 다 . 희석 되 지 않 은 용해 물 ( 포화 돌연변이 유발 라이브러리 ) 또는 32 x 희석 된 용해 물 ( 라운드 9 조합 라이브러리 ) 를 트리스 - HCl , pH 7 . 5 에 첨가 하 였 다 . 효소 를 열 로 자극 하 기 위해 라운드 9 라이브러리 용해 물 을 62 ℃ 에서 1 시간 ( 조합 라이브러리 ) 또는 3 . 75 시간 ( 포화 돌연변이 유발 라이브러리 ) 동안 사전 인 큐 베이 팅 하 였 다 . 이어서 , 10 μ L 의 희석 된 SuS 용해 물 및 1 g / L GT 서열 번호 3244 ( Rd 12 B ) 를 15 mM 레바 우디 오시드 A 97 의 기질 로딩 및 0 . 2 mM ADP ( Sigma , > 95 %), 45 mM 수크로스 ( 자당 ) 및 9 mM 프럭토스 ( Sigma ) 의 보조 기질 로딩 과 함께 100 μ L 반응 부피 에서 조합 하 였 다 . 하 기 반응 조건 을 사용 하 였 다 : 2 - 3 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 ® 적정 플레이트 진탕기 에서 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 6 , 60 ℃. 상기 설명 한 반응물 은 10 μ L 검정 물 을 390 μ L 의 물 에 첨가 하 여 가용화 하 고 , 20 μ L 의 가용화 된 검정 물 을 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 180 μ L 아세 토니 트릴 에 첨가 함 으로써 켄 칭 하 고 , 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 상청 액 을 물 에 3 . 3 배 희석 한 후 , 스 테 비올 글리코시드 생성물 을 표 31 . 1 에 기재 된 기기 및 파라미터 를 사용 하 여 RapidFire SPE - MS / MS 에 의해 검출 하 였 다 . 분석 후 에 , 레바 우디 오시드 A 에 대해 GT 와 결합 된 개선 된 활성 을 나타내 는 24 개 의 조작 된 SuS 변이체 폴리펩티드 가 확인 되 었 다 . 생성 된 조작 된 폴리펩티드 는 표 35 . 1 에 열거 되 어 있 다 . 표 35 . 2 에 나타낸 아미노산 돌연변이 를 갖 는 변이체 에 대해 실시 예 31 에 기재 된 바 와 같 은 단백질 특성 화 를 위해 진탕 플라스크 규모 배 양물 을 성장 시켰 다 .