분석 전날 , SJSA - 1 세포 를 80 만 개 세포 / 2 ㎖/ 웰 의 밀도 로 6 웰 플레이트 에 시 딩 한다 . 연구 당일 , 세포 를 옵 티 - MEM 배지 로 1 회 세척 하 고 , 1350 ㎕ 의 옵 티 - MEM 배지 를 세포 에 첨가 한다 . 펩티드 를 10 mM DMSO 저장액 으로부터 멸 균수 중 의 500 μ M 작업 저장액 까지 희석 하 고 , DMSO 의 농도 가 샘플 들 사이 에 일정 하 게 유지 되 도록 0 . 5 % DMSO 로 더 희석 한다 . 가장 높 은 최종 DMSO 농도 는 0 . 5 % 이 고 음성 대 조군 으로서 사용 된다 . 케이맨 케미 칼스 의 세포 에 기초 한 분석 ( -)- 뉴 틀린 - 3 ( 10 mM ) 이 양성 대 조군 으로서 사용 된다 . 펩티드 와 동일 한 희석 방식 을 이용 하 여 뉴 틀린 을 희석 한다 . 150 ㎕ 의 10 X 원 하 는 농도 를 적절 한 웰 에 첨가 하 여 최종 원 하 는 농도 를 달성 한다 . 그 다음 , 습한 5 % CO 2 대기 하 에 37 ℃ 에서 세포 를 펩티드 와 함께 18 시간 내지 20 시간 동안 인 큐 베이 션 한다 . 인 큐 베이 션 시간 후 , 세포 를 수거 하 여 1 X PBS ( Ca ++/ Mg ++ 무 함유 ) 로 세척 하 고 얼음 상 에서 1 X 세포 용해 완충제 ( 1 X 까지 희석 되 고 프로테아제 억제제 및 포스 파타 제 억제제 로 보충 된 셀 시 그날 링 테크 놀 로지스 ( Cell Signaling technologies ) 10 X 완충제 ) 로 30 분 동안 용해 시킨다 . 용해 물 을 4 ℃ 에서 미세 원심분리기 내 에서 13000 rpm 속도 로 8 분 동안 원심 분리 하 고 , 투명 한 상청 액 을 수집 하 고 추가 사용 시 까지 - 80 ℃ 에서 저장 한다 . 써 모피 셔 ( Thermofisher ) 로부터 의 BCA 단백질 검출 키트 및 BSA 표준물 을 사용 하 여 상기 용해 물 의 총 단백질 함량 을 측정 한다 . p 21 검출 ELISA 분석 을 위해 25 ㎍ 의 총 단백질 을 사용 한다 . ELISA 플레이트 에 대한 각각 의 조건 을 삼중 으로 설정 한다 . 제조자 의 지시 에 따라 ELISA 분석 프로토콜 을 따른다 . 각각 의 웰 에 대해 25 ㎍ 의 총 단백질 을 사용 하 고 , 각각 의 웰 을 삼중 으로 준비 한다 . 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 를 이용 하 여 데이터 를 분석 한다 .