다음 날 , 피 험 화합물 ( 종 농도 1 , 000 nM 에서부터 0 . 3 nM 의 범위 에서 6 점 ) , 양성 대조 로서 종 농도 1 μ M 의 트라 메티 닙 ( 글 락소 스미스 클라 인사 ; MEK 저해제 ) 및 음성 대조 로서 피 험 화합물 의 용매 인 DMSO 를 신선 한 배지 로 100 배 희석 하 여 , 4 μ L 씩 각 웰 에 첨가 한 후 , 2 시간 배양 했 다 . 배양 후 빠르 게 , 각 웰 에 30 % 글리옥살 액 ( Wako 사 ; 40 % 글리옥살 을 Phosphate Buffered Saline ( PBS ; Wako 사 ) 로 희석 ) 을 30 μ L 첨가 하 여 , 1 시간 실온 에서 정치 함 으로써 세포 를 고정 했 다 . 그 후 , 플레이트 를 원심 ( 110 xg , 7 초간 , 이하 특별히 기재 하 지 않 는 한 원심 은 같 은 조건 으로 행했 다 ) 함 으로써 상청 을 제거 하 고 , 0 . 1 % Triton X - 100 ( Amersham Biosciences 사 ) 함유 PBS 를 20 μ L 씩 각 웰 에 첨가 했 다 . 10 분 간 실온 정치 후 , 원심 에 의해 상청 을 제거 하 고 , 또한 동일 한 조작 을 반복 했 다 . 이어서 , 0 . 5 % SDS ( Invitrogen 사 ) 함유 PBS 를 20 μ L 씩 각 웰 에 첨가 하 여 , 실온 에서 30 분 간 정치 후 , 원심 함 으로써 상청 을 제거 했 다 . 이어서 , 블로킹 용액 ( ODYSSEY Blocking Buffer ; LI - COR Biosciences 사 ) 을 20 μ L 씩 각 웰 에 첨가 하 여 1 시간 실온 에서 정치 했 다 . 원심 에 의해 상청 을 제거 하 고 , 1 차 항체 로서 ERK ( Thr 202 / Tyr 204 ) 의 인산화 항체 ( Cell Signaling Technology 사 ) 를 원액 에 대하 여 1 / 2 , 500 량 이 되 도록 희석 한 블로킹 용액 을 10 μ L 씩 각 웰 에 첨가 하 여 , 4 ℃ 에서 밤새 정치 했 다 .