자궁암 세포주 HeLa ( KCLB No . 10002 ) 를 10 % FBS , 1 % Pen / Strep 이 첨가 된 DMEM ( SH 30243 . 01 , Hyclone ) 배양액 에서 37 ℃, 5 % CO 2 조건 으로 유지 시켰 다 . 상기 실시 예의 화합물 들 의 IDO 효소 활성 저해 효과 측정 을 위해 상기 세포주 는 1 . 5 x 104 cells 의 세포 수 로 96 well cell culture plate 에 플 레이팅 하 고 , 여기 에 50 ng / ml IFN - γ 을 24 시간 동안 첨가 하 였 다 . 이 로부터 24 시간 후 DMEM ( SH 30284 . 01 , Hyclone ) 에 10 % FBS , 1 % Pen / Strep 가 포함 된 배양액 으로 기존 배양액 과 교체 한 후 , 최종 처리 농도 10 μ M , 30 μ M , 100 μ M ( 1 . 5 % DMSO ) 에 맞추 어 상기 화합물 을 첨가 한 뒤 , 이 를 24 시간 동안 추가 배양 하 였 다 . 이후 , Tissue culture plate 각 well 의 배양 상층 액 100 μ l 를 96 well plate 로 옮긴 뒤 , 20 μ l 30 % TCA ( Trichloroacetic acid ) 를 첨가 하 여 65 ℃ 에서 15 분 간 incubation 하 였 다 . 이후 , 이 를 3 , 000 xg 에서 10 분 간 원심 분리 한 뒤 , 상등 액 100 μ l 를 새로운 96 well plate 로 옮겼 다 . 이후 , 상등 액 과 동량 ( 100 μ l ) 의 Ehrlich ’ s reagent ( Acetic acid 에 녹인 2 % p - dimethylaminobenzaldehyde ) 를 첨가 하 여 5 분 간 반응 시켰 다 . 이후 , microplate reader 480 nm 에서 흡광도 를 측정 하 여 발색 수준 을 평가 하 였 고 , 이 에 기초 하 여 IC 50 를 산출 하 였 다 .