재수 임 , 옥화 강 , 윤수 서 , 동렬 권 
 The Korea Journal of Herbology . 2015 . Sep , 30 ( 5 ) : 67 - 74 
 DOI : http : / / dx . doi . org / 10 . 6116 / kjh . 2015 . 30 . 5 . 67 . 
 The Haedokgumhwa - san water extract ( HDKHS ) is used in Korea , Japan and China as a traditional therapeutic agent to cure an infectious disease . But its study is not enough . Therefore , the present study focused on the elucidation of HDKHS to investigate the anti - inflammatory effects and to established the possible mechanisms involved in its action on LPS - stimulated immune response in murine macrophages . 
 Inflammatory status was induced by LPS and measured by increasement of inflammatory mediators . LPS induced secretions of NO and PGE 2 in RAW 264 . 7 cells were measured using griess reagent and enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) kit respectively . production of IL - 6 was examined using ELISA kit and expression of IL - 6 mRNA was measured by RT - PCR method . To investigate the effects of HDKHS on inflammatory mediators , such as iNOS , COX - 2 and MAPKs , western blot and RT - PCR were performed . 
 HDKHS significantly reduced production of NO and PGE 2 which were induced by LPS . Also , activation of IL - 6 was reduced both protein and mRNA levels . The expressions of inflammatory mediator include iNOS and COX - 2 were decreased by pretreatment with HDKHS . futhermore The result showed HDKHS down - regulate the LPS induced phosphorylation of ERK 1 / 2 , one of the MAPK family , which is considered as a main regulator of transmission from pathogens to nucleus of immune cells . 
 Our results suggest that the anti - inflammatory properties of HDKHS may stem from the inhibition of pro - inflammatory mediators via suppression of initiation of inflammatory response by inhibiting MAPKs signaling pathways . 
 염증 은 다양 한 형태 의 감염 이나 생체 내 대사산물 중 자극 성 물질 에 의해 혈관 이 확장 되 어 세포막 의 유동 성 이 증가 하 고 부종 이 일어나 며 이 를 통해 손상 된 부위 를 복구 시키 려는 정상 적 인 생체 방어 기전 으로서 조직 의 변성 , 순환 장애 와 삼출 , 조직 증식 의 세 가지 를 유발 하 는 복합 적 인 병변 으로 주요 증상 으로 는 발열 , 발적 , 동통 , 부종 등 이 있 다 1 , 2 ) . 
 한방 적 관점 에서 염증 은 그 증상 의 유사 성 을 보 았 을 때 癰 , 疽 , 瘡 , 疢 등 과 관계 가 깊 다 . 『 靈 樞 · 癰疽 篇 』 에서 " 營 氣 가 경맥 속 에 머무르 면 營血 이 응체 되 어 순행 하 지 못하 고 순행 하 지 못하 면 衛氣 가 이 를 따라 통하 지 않 으니 , 衛氣 가 막혀 순행 할 수 없 으므로 熱 이 나 고 , 심한 熱 이 멎 지 않 아서 熱 이 왕성 하 면 肌 肉 이 腐爛 되 고 , 肌 肉 이 腐爛 되 면 化膿 된다 3 ) . " 고 하 여 營 氣 와 衛氣 의 불통 을 염증 의 기전 을 제시 하 고 있 다 . 또한 염증 의 발열 및 혈관 확장 은 한방 적 으로 熱 證 의 속성 을 가지 고 있 으므로 熱 證 의 속성 을 가진 化膿 과 그 속성 이 유사 함 을 알 수 있 다 . 膿血 이 란 피고름 이 섞여 있 는 것 을 말 하 며 , 膿血 痢 는 이질 에 의해 피고름 이 섞인 대변 을 누 는 증상 을 나타낸다 . 이 는 , 濕熱 毒 이 大腸 에 몰려 氣 와 血 이 傷 하 게 되 어 일반 痢 疾 증상 과 함께 大便 에 피 와 고름 이 섞여 나오 는 증상 으로 주로 瘡瘍 이 터져 泄瀉 와 함께 나오 는 것 으로 볼 수 있 을 것 이 다 4 ) . 瘡瘍 에 는 腫瘍 과 癰 , 疽 등 이 포함 되 며 , 주로 邪毒 이 침입 하 여 생긴 邪 熱 로 인해 血 이 상하 게 되 어 氣血 이 몰려 있 는 것 으로 한방 적 으로 熱 證 의 속성 을 가지 고 있 다 . 한방 에서 는 ' 諸 痛 瘡瘍 皆 屬 於 火 ' 라고 하 여 모든 痛 , 瘡瘍 은 火 의 성질 을 가진다고 하 였 다 . 瘡瘍 에 동반 되 어 나타나 는 火 , 즉 , 熱 證 의 속성 은 인체 의 氣 가 邪氣 와 다투 는 과정 에서 나타나 는 면역 반응 으로 이것 은 염증 과 그 양상 이 유사 함 을 알 수 있 다 . 또한 瘀血 , 痰飮 , 氣鬱 등 이 지속 되 면 여러 조건 에 의해 化 火 하 여 內 火 로서 작용 하 여 인체 의 恒 常性 도 깨뜨리 게 된다 5 ) . 
 解毒 金 花 散 은 금원 사대가 중 한 명 인 元 나라 朱丹 溪 의 경험 처방 으로 『 丹溪 心法 』 19 편 痢 에서 下痢 膿血 毒 을 치료 한다고 수록 되 어 있 고 『 東醫 寶鑑 』 내 경편 4 권 중 大便 편 痢 疾 諸 證 膿血 痢 에서 는 熱毒 膿血 痢 를 치료 한다고 되 어 있 다 6 , 7 ) . 解毒 金 花 散 은 黃 連 · 黃柏 각 2 錢 , 黃芩 · 白朮 · 赤 芍藥 · 赤 茯苓 각 1 錢 으로 구성 되 어 있 다 . 黃 連 , 黃芩 , 黃柏 에 梔子 가 더 해진 黃 連 解毒 湯 8 ) 은 一切 熱毒 에 사용 할 수 있 다 . 白 芍藥 , 白朮 , 白 茯苓 세 가지 약재 와 炙 甘草 로 구성 된 것 이 三白湯 인데 一切 泄瀉 9 ) 에 사용 한다 . 黃 連 解毒 湯 과 三白湯 의 의미 가 합해 있 는 처방 인 解毒 金 花 散 은 전통 적 으로 膿血 痢 와 같 은 감염 으로 인한 염증 성 질환 에 사용 되 어 온 처방 으로 항 염증 활성 을 가지 고 있 을 것 으로 예상 되 지만 , 아직 Methicillin - Resistant Staphylococcus aureus ( MRSA ) 에 대한 항균 효과 에 대해서 만 보고 가 되 어 있 을 뿐 10 ) , 解毒 金 花 散 의 항 염증 작용 과 그 에 대한 기전 의 연구 가 미흡 한 실정 이 다 . 
 따라서 이번 연구 에서 는 LPS 를 처리 한 RAW 264 . 7 cells 을 이용 하 여 黃 連 解毒 湯 의 항 염증 활성 을 검증 하 고 그 기전 을 밝히 고자 한다 . 
 자 극원 으로 사용 한 LPS ( E . coli lipoplysaccaride ) , 세포 배양 에 사용 되 는 RPMI - 1640 배지 와 Penicillin - Streptomycin , Bovine Serum Albumin ( BSA ) 는 Sigma - Aldrich ( St Louis , MO , USA ) 로부터 구입 하 였 고 , Fetal bovine serum ( FBS ) 는 Hyclone ( New zealand ) 제품 을 구입 해 사용 하 였 다 . 조직 배양 플레이트 와 직경 100 ㎜ 페트리 접시 는 넌 크 사 ( Nunc , Inc , USA ) 로부터 구입 하 여 사용 하 였 다 . 세포 독성 측정 에서 필요 한 CellTiter 96 ® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay ( MTS ) 는 Promega ( Madison , Wisconsin , USA ) 에서 구입 하 였 다 . PGE 2 EIA kit 와 IL - 6 ELISA kit 를 R & D 시스템스 ( MN , USA ) 로부터 구입 하 였 다 . Western blot 실험 에서 필요 한 Protein Extraction Solution 은 iNtRON Biotechnology ( Gyeonggi - do , Korea ) 에서 구입 하 였 고 , Ponceau S solution 은 Sigma ( St . Louis , Mo , USA ) , EzReprobe 은 ATTO ( Tokyo , Japan ) 에서 구입 하 였 다 . COX - 2 , iNOS , β - actin , MAPKs ( ERK , JNK , p 38 ) , 단일 세포 항체 및 peroxidaseconjugated 된 secondary antibody 는 Santa Cruz Biotechnology ( CA , USA ) 에서 구입 하 였 다 . PCR 실험 에서 사용 된 Easy Blue total RNA Extraction kit 는 iNtRON Biotechnology ( Gyeonggi - do , Korea ) , Reverse Transcription kit 는 Giagen ( Valencia , CA , USA ) , Sensi 2 × PCR premix 은 Lugen , Gel red , 6 × loading buffer 는 Dynebio ( Gyeonggi - do , Korea ) , Primer 는 Bioneer ( Daejeon , Korea ) 에서 구입 해 사용 하 였 다 . 
 RT - PCR 을 위해 여러 개 의 primer 를 사용 하 였 다 . Primer 의 구성 은 table 1 과 같 다 . 
 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 은 ( 주 ) 백제 허브 에서 구입 한 黃 連 , 黃柏 , 黃芩 , 白朮 , 赤 芍藥 , 赤 茯苓 을 3 차 증류수 ( 100 g / L ) 로 2 시간 환류 추출 하 여 준비 하 였 다 . 그 추출물 을 0 . 45 μ m filter paper 로 여과 후 rotary evaporatory ( EYEIA , JAPAN ) 로 감압 농축 후 동결 건조 하 였으며 , 2 . 8 g 이 얻 어 져 4 ℃ 에서 보관 하 였 다 . 동결 건조 된 추출물 은 실험 하 기 위하 여 인산 완충 식염수 ( phosphate - buffered saline . PBS ) 에 용해 하 였 다 ( Table 2 ) . 
 The composite ofHaedokgumhwa - san 
 The composite of Haedokgumhwa - san 
 본 실험 에 사용 된 세포 인 murine macrophage cell line , RAW 264 . 7 세포 는 한국 세포주 은행 으로부터 구입 하 여 사용 하 였 다 ( Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology American Tissue Culture Collection ) . 대식세포 는 항생제 및 항균 제 로서 100 U / mL 의 페니실린 과 100 μ g / mL 의 streptomycin 을 첨가 하 고 10 % 열처리 우태 아 혈청 ( heat inactivated FBS ) 을 첨가 한 완전 한 RPMI 1640 배지 에서 5 % CO 2 의 습한 대기 , 37 ℃ 의 온도 조건 으로 배양 하 였 다 . 이 때 사용 한 FBS 는 사용 하 기 전 56 ℃ 에서 30 분 간 heat - inactivation 시켜 사용 하 였 다 . 
 100 mm culture dish 에 부착 된 세포 들 을 cell scraper 를 이용 하 여 세포 를 이탈 시킨 후 , hemocytometer 를 이용 하 여 세 포수 를 계산 하 였 다 . 이 후 실험 방법 에 따라 적정 농도 로 희석 한 후 well - plate 에 접종 하 여 배양 하 였 다 . HDKHS 은 각각 PBS 에 용해 시킨 후 접종 한 지 24 시간 후 에 RAW 264 . 7 세포 만 을 배양 한 정상 군인 대 조군 , LPS 로 자극 한 대 조군 , LPS 와 시료 를 농도 별 로 동시 에 처리 한 실험 군 으로 분류 하 였 다 . 
 - 4 ) MTS 분석 
 RAW 264 . 7 세포 ( 5 × 10 4 cells / mL ) 를 96 - well culture plate 에 RPMI 1640 배지 와 함께 100 μ L 로 분주 한 뒤 하룻밤 배양 한 다음 , HDKHS ( 50 , 100 , 250 과 500 μ g / mL ) 을 각각 처리 하 여 24 시간 배양 하 였 다 . 각 well 에 5 mg / mL 농도 의 MTS 용액 을 20 μ L 씩 넣 은 후 2 시간 동안 배양 하 면서 환원 반응 을 유도 하 여 발색 정도 를 microplate reader 를 이용 하 여 490 nm 에서 흡광도 를 측정 하 였으며 , 세포독성 ( cell toxicity ) 은 세포 만 배양 한 무 처리 군 의 생존 도 100 % 를 기준 으로 약물 처리 군 의 상대 적 인 세포 생존 율 을 계산 하 였 다 . 
 PBS 로 희석 한 HDKHS 을 여러 농도 ( 50 , 100 , 250 및 500 g / mL ) 로 처리 하 고 여기 에 LPS ( 200 ng / mL ) 를 각각 주입 한 다음 상기 대식세포 RAW 264 . 7 을 24 시간 배양 하 였 다 . 대식세포 의 상층 액 을 수집 하 여 Griess reagent ( 1 % sulfanilamide , 0 . 1 % N -( 1 - naphthyl ) - ethylene diamine dihydrochloride in 2 . 5 % phosphoric acid solution ) 와 동량 으로 주입 한 후 10 분 간 실온 에서 방치 하 였 다 . 반응 후 상층 액 의 흡광 도 값 은 Microplate reader 를 이용 하 여 570 ㎚ 에서 측정 하 였 다 . 아질산 0 - 30 μ M 의 흡광 도 값 을 측정 하 여 이 값 을 기준 으로 하 여 여러 실험 군 의 생성 된 NO 의 흡광 도 값 을 정량 하 였 다 . 
 - 6 ) Enzyme - Linked Immunosorbent Assay 
 RAW 264 . 7 세포 를 RPMI 1640 배지 를 이용 하 여 5 × 10 5 cells / mL 로 조절 한 후 24 well plate 에 접종 하 고 , 5 % CO 2 항온기 에서 18 시간 전 배양 하 였 다 . 이후 배지 를 제거 하 고 HDKHS 을 각각 100 , 250 , 500 μ g / mL 농도 로 1 시간 동안 처리 한 후 , 그람 - 음성 박테리아 내독소 인 LPS ( 200 ng / mL ) 로 RAW 264 . 7 대식 세포 를 자극 한 후 세포 부 유액 을 원심 분리 하 여 세포 들 을 침전 시켜 상층 액 을 수집 하 고 , 상층 액 내 IL - 6 생성량 을 ELISA kit ( R & D Systems Inc . , Minneapolis , MN , USA ) 를 이용 하 여 사용 자 매뉴얼 에 기재 된 방법 대로 정량 해 분석 하 였 다 . 
 RAW 264 . 7 세포 를 RPMI 1640 배지 를 이용 하 여 5 × 10 5 cells / mL 로 조절 한 후 24 well plate 에 접종 하 고 , 5 % CO 2 항온기 에서 18 시간 전 배양 하 였 다 . 이후 배지 를 제거 하 고 HDKHS 을 각각 100 , 250 , 500 μ g / mL 농도 로 1 시간 동안 처리 한 후 , 그람 - 음성 박테리아 내독소 인 LPS ( 200 ng / mL ) 로 RAW 264 . 7 대식 세포 를 자극 한 후 세포 부 유액 을 원심 분리 하 여 세포 들 을 침전 시켜 상층 액 을 수집 하 고 , 상층 액 내 PGE 2 생 성양 을 EIA kit ( R & D Systems Inc . , Minneapolis , MN , USA ) 를 이용 하 여 사용 자 매뉴얼 에 기재 된 방법 대로 정량 해 분석 하 였 다 . 
 배양 이 끝난 세포 를 수집 하 여 2 - 3 회 PBS 로 세 척 한 후 1 mL 의 lysis buffer 을 첨가 하 여 20 분 간 lysis 시킨 후 13 , 000 rpm 에서 5 분 간 원심 분리 하 여 세포막 성분 등 을 제거 하 였 다 . 단백질 정량 은 BSA 와 Bio - Rad protein Assay Kit 를 사용 하 였 고 , microplate reader 를 이용 하 여 595 nm 에서 흡광도 를 측정 하 고 정량 하 였 다 . 20 - 30 μ g 의 lysate 를 8 - 12 % mini gel SDS - PAGE 로 변성 분리 하 여 , 이 를 PVDF ( polyvinylidene difluoride ) membrane ( BIO - RAD , Richmond , CA , USA ) 에 200 mA 로 2 시간 동안 transfer 하 였 다 . 그리고 Ponceau S solution 으로 염색 한 후 , Transfer 가 잘 되 었 는지 확인 하 였 다 . 그리고 membrane 의 blocking 은 5 % skim milk 가 함유 된 TBS - T ( TBS + 0 . 05 % Tween 20 ) 용액 에서 상온 에서 1 시간 동안 실시 하 였 다 . MAPKs 의 발현 양 을 검토 하 기 위한 항체 로 는 ERK anti - mouse ( 1 : 1000 ) ( Calbiochem , La Jolla , CA , USA ) 를 TBST 용액 에서 희석 하 여 상온 에서 3 시간 반응 시킨 후 TBST 로 15 분 간 3 회 세정 하 였 다 . 2 차 항체 로 는 HRP ( horse radish peroxidase ) 가 결합 된 anti - mouse IgG ( Amersham Pharmacia Biotech , Little Chalfont , UK ) 를 1 : 2000 으로 희석 하 여 상온 에서 1 시간 반응 시킨 후 , TBST 로 3 회 세정 하 여 ECL 기질 ( Amersham Biosciences , Piscataway , NJ , USA ) 과 1 - 3 분 간 반응 후 ImageQuant TM LAS 4000 mini 을 이용 하 여 단백질 발 현량 을 분석 하 였 다 . 
 - 9 ) RNA 분리 및 RT - PCR 
 HDKHS 에 의한 COX - 2 와 iNOS 발현 과 의 상관 성 을 알아보 기 위하 여 RT - PCR 로 mRNA 발현 을 조사 하 였 다 . RNA 및 RT - PCR RNA 세포 의 준비 는 6 - well culture plate 에 2 × 10 6 cells / mL 의 농도 로 세포 로 분주 한 다음 , 하루 밤 동안 안정 화 시켰 다 . 이 세포 에 HDKHS ( 100 , 250 , 500 μ g / mL ) 을 처리 한 후 , LPS 로 자극 하 고 24 시간 후 에 세포 를 모아 PBS 로 세척 하 여 이지 블루 ( easy blue , 인트론 사 ) 1 mL 을 가하 여 실온 에서 교반 하 였 다 . 클로로포름 200 ㎕ 를 넣 고 다시 교반 하 여 13 , 000 rpm , 4 ℃ 에서 10 분 간 원심 분리 한 다음 , 상등 액 400 μ l 에 isopropanol 동량 을 가하 여 다시 원심 분리 하 여 상층 액 을 제거 한 뒤 70 % EtOH 로 2 회 세척 한 후 , DEPC 가 처리 된 증류수 에 용해 시켰 다 . cDNA 를 합성 하 기 전 Nano Drop 기계 로 A 260 / A 280 nm 의 비율 이 1 . 6 ~ 2 . 0 범위 내 의 값 을 갖 는 RNA 시료 를 실험 에 사용 하 였 다 . cDNA 합성 은 Reverse Transcription kit 를 사용 하 였 다 . cDNA 에 IL - 6 , B - actin , COX - 2 , iNOS Primer 를 넣 고 유전자 증폭기 를 이용 하 여 증폭 시켰 다 . 2 % Agarose Gel 에 Gel red 를 1 : 10 , 000 희석 시켜 전기영동 한 후 , UV 검출기 로 발현 정도 를 확인 하 였 다 . 
 모든 실험 은 3 회 이상 반복 으로 이루 어 졌으며 , 실험 결과 는 각 항목 에 따라 평균치 ± 표준편차 ( SD ) 를 구하 여 그 유의성 은 SPSS ( ver . 22 ) 를 사용 하 여 Student ' s t - test 분석법 을 따라 분석 하 였으며 , 신뢰 수준 95 % ( p < 0 . 05 ) 에서 통계 적 유의차 를 평가 하 였 다 . 
 - 1 . 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 세포 생존 율 에 대한 영향 
 RAW 264 . 7 세포 에서 HDKHS 의 세포 생존 율 을 MTS assay 방법 으로 조사 하 였 다 . 그 결과 , HDKHS 50 , 100 , 250 , 500 μ g / mL 의 농도 에서 는 세포독성 이 나타나 지 않 았 다 . 따라서 이후 실험 은 세포 독성 이 없 는 농도 범위 에서 수행 하 였 다 ( Fig . 1 ) . 
 Effect of HDKHS on cell viability in RAW 264 . 7 cells . 	 The cell viability assessed using an MTS assay following incubation with different doses ( 50 , 100 , 250 and 500 μ g / mL ) of HDKHS for 24 hours . 
 - 2 . NO 생성 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 NO 생성 에 대한 HDKHS 의 항 염증 효과 를 알아보 기 위해 Griess reagent 시약 을 이용 한 방법 으로 세포 배양액 중 에 존재 하 는 NO 2 의 형태 를 측정 하 였 다 . HDKHS 은 250 μ g / mL , 500 μ g / mL 의 처리 농도 에서 각각 농도 의존 적 이 고 유의 적 으로 NO 생성 이 억제 되 는 것 으로 나타났 다 ( Fig . 2 ) . 
 Effect of HDKHS on NO production LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells . 	 RAW 264 . 7 cells were pre - treated with the indicated concentration of HDKHS for 30 minutes before being incubated with LPS ( 200 ng / mL ) for 24 hours . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 - 3 . PGE 2 생성 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 대식세포 매개 PGE 2 는 COX - 1 과 COX - 2 로부터 생성 되 는데 , 소량 의 경우 생체 대사 에 필수 적 이 지만 유도 성 COX - 2 의 과 발현 에 의한 과량 의 PGE 2 는 강력 한 염증 매개물 질 로 작용 하 는 것 으로 보 고 되 어 있 다 . 따라서 본 연구 에서 는 PGE 2 를 대상 으로 HDKHS 의 약리학 적 인 효능 평가 를 실시 하 였 다 . RAW 264 . 7 대식세포 에 HDKHS 을 각각 100 , 250 , 500 μ g / mL 의 농도 로 1 시간 동안 처리 한 후 , LPS ( 200 ng / mL ) 로 세포주 를 자극 하 여 1 시간 후 세포 부 유액 을 원심 분리 하 여 상층 액 을 수집 하 고 PGE 2 생 성양 을 측정 한 결과 , Normal 에서 는 PGE 2 생 성양 이 매우 낮 게 측정 되 었 으나 , LPS 의 자극 에 의해 현저히 증가 되 었 다 . 반면 , HDKHS 을 처리 한 그룹 가운데 250 , 500 μ g / mL 의 농도 에서 농도 의존 적 으로 PGE 2 생성 이 억제 되 는 것 을 확인 할 수 있 었 다 ( Fig . 3 ) . 
 Effect of HDKHS on PGE 2 production in LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells . 	 RAW 264 . 7 cells were pre - treated with the indicated concentration of HDKHS for 30 minutes before being incubated with LPS ( 200 ng / mL ) for 24 hours . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 - 4 . COX - 2 와 iNOS 의 단백질 발현 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 HDKHS 의 COX - 2 와 iNOS 의 단백질 발현 에 대한 효과 를 알아보 기 위해 Western blot 을 수행 하 였 다 . 그 결과 , LPS 처리 에 의해 증가 된 COX - 2 와 iNOS 의 단백질 발현 은 약물 처리 시 억제 되 는 양상 을 보였으며 500 μ g / mL 으로 처리 시 iNOS 의 발현 이 현저 하 게 억제 되 는 것 을 확인 하 였 다 ( Fig . 4 ) . 
 Effect of HDKHS on protein expression of COX - 2 and iNOS in LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells . 	 The cell were pre - treated with HDKHS for 30 minutes , and then incubated with LPS ( 200 ng / mL ) for indicated time . Detail methods were described in Materials and Methods . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 - 5 . COX - 2 와 iNOS 의 mRNA 발현 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 HDKHS 의 COX - 2 와 iNOS 의 mRNA 발현 에 대한 효과 를 알아보 기 위해 RT - PCR 을 수행 하 였 다 . 그 결과 , LPS 처리 에 의해 증가 된 COX - 2 와 iNOS 의 mRNA 발현 은 약물 처리 시 농도 의존 적 으로 억제 되 는 양상 을 보였으며 500 μ g / mL 으로 처리 시 현저 하 게 억제 되 는 것 을 확인 하 였 다 ( Fig . 5 A , B ) . 
 Effect of HDKHS on the mRNA expression of iNOS and COX - 2 in LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells . 	 The cells were pre - treated with HDKHS as indicated concentrations for 30 minutes , and then incubated with or without LPS ( 200 ng / mL ) for 24 hours . iNOS and COX - 2 mRNA transcription level was assessed by RT - PCR . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 - 6 . IL - 6 생성 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 RAW 264 . 7 세포 에 LPS 를 처리 하 였을 때 약물 처리 군 의 경우 정상대 조군 에 비해 IL - 6 생성량 이 급격히 증가 하 였 다 . HDKHS 을 처리 하 였을 때 IL - 6 의 생성량 이 농도 의존 적 으로 감소 하 였 다 ( Fig . 6 ) . 
 Effect of HDKHS on the productions of IL - 6 in LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells 	 The cells were treated with HDKHS at indicated concentrations for 30 minutes , and then incubated with 200 ng / mL LPS for 18 hours as described in materials and methods . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 - 7 . IL - 6 의 mRNA 발현 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 HDKHS 의 IL - 6 의 mRNA 발현 에 대한 효과 를 알아보 기 위해 RT - PCR 을 수행 하 였 다 . 그 결과 , LPS 처리 에 의해 증가 된 IL - 6 의 mRNA 발현 은 약물 처리 시 농도 의존 적 으로 억제 되 는 양상 을 보였으며 500 μ g / mL 으로 처리 시 현저 하 게 억제 되 는 것 을 확인 하 였 다 ( Fig . 7 ) . 
 Effect of HDKHS on the mRNA expression of IL - 6 in LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells 	 The cells were pre - treated with HDKHS as indicated concentrations for 30 minutes , and then incubated with or without LPS ( 200 ng / mL ) for 24 hours . IL - 6 mRNA transcription level was assessed by RT - PCR . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 - 8 . MAPKs 의 인산화 에 대한 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 억제 효과 
 MAPKs 는 세포 의 성장 과 분화 및 cytokines 과 스트레스 제어 에 중요 한 역할 을 한다 . 따라서 HDKHS 의 억제 메커니즘 이 MAPKs 를 경유 하 는지 알아보 기 위해 MAPKs 의 인산화 를 Western blot 을 통해 확인 하 였 다 . 그 결과 LPS 에 의해 활성 화 된 RAW 264 . 7 세포 에 HDKHS 을 100 , 250 , 500 μ g / mL 을 처리 한 경우 ERK 1 / 2 의 인산화 를 억제 하 는 것 을 확인 하 였 다 ( Fig . 8 ) . 그러나 JNK 1 / 2 와 p 38 의 인산화 에 는 영향 이 없 는 것 을 확인 할 수 있 었 다 . 
 Effect of HDKHS on the phosphorylation ( P -) of MAPKs in LPS - stimulated RAW 264 . 7 cells 	 RAW 264 . 7 cells were treated with the indicated concentrations of HDKHS for 30 minutes before being incubated with LPS ( 200 ng / mL ) for 30 minutes . Date are mean ± SD values of triplicate determinations from three separate experiment . * P < 0 . 05 . when compared to the LPS treated group . 
 解毒 金 花 散 은 元 代 의 丹溪 心法 19 편 痢 에 처음 수록 된 처방 으로 下痢 膿血 毒 을 치료 하 는 데 사용 되 었 으며 東醫 寶鑑 내 경편 에서 는 熱毒 으로 인한 膿血 痢 를 치료 한다고 되 어 있 다 6 , 7 ) . 解毒 金 花 散 은 각종 出血 , 鬱血 에 사용 하 여 高 血壓 , 코피 , 전체 적 인 熱感 , 옻 이 올랐 을 때 , 紅 疫 등 과 같 은 일체 열독 에 사용 할 수 있 는 黃 連 解毒 湯 과 일체 泄瀉 에 쓰 는 三白湯 이 大腸 濕熱 로 인한 膿血 痢 를 凊 熱 시키 고 燥濕 시켜서 치료 하 는 것 이 다 . 黃 連 , 黃芩 , 黃柏 은 淸熱 燥濕 藥 에 속하 고 , 白朮 은 補氣 藥 , 赤 茯苓 은 利 水 退 腫 藥 , 赤 芍藥 은 淸熱 凉 血 藥 에 속한다 . 즉 , 黃 連 , 黃柏 , 黃芩 , 赤 芍藥 으로 熱 을 꺼주 고 濕 을 없애 며 , 白朮 과 赤 茯苓 으로 물길 을 바로잡 아 濕 의 산물 인 水腫 을 없애 주 는 것 이 다 . 
 대식세포 는 면역 기능 을 조절 하 고 이 에 따른 염증 반응 에 관여 하 는 생체 방어 체계 의 주요 요소 로서 , 외부 의 항원 과 자극 에 의해 활성 화 되 어 성장 인 자 , cytokines , PGE 2 와 lipid mediator 및 NO 를 다량 분비 하 여 그 역할 을 수행 한다 11 ) . 그러나 대식세포 가 과도 하 게 활성 화 되 면 염증 매개 물질 분비 를 증가 시켜 염증 을 심화 시킴 으로서 천식 , 기관지염 , 관절염 , 다발 성 경화증 , 동맥경화증 , 뇌졸중 , 알츠하이머병 이나 파킨슨병 과 같 은 퇴행 성 뇌 질환 및 바이러스 감염 으로 인한 염증 질환 등 을 유발 하 고 , 질환 을 악화 시키 는 데 기여 하 게 된다 12 , 13 ) . 
 LPS 는 대표 적 인 외부 자극 원 중 의 하나 로 그람 음성균 의 세포 표면 을 구성 하 는 물질 로서 대식세포 와 같 은 염증 성 세포 를 활성 화 시켜 선천 면역 뿐 만 아니 라 적응 면역 등 에 관여 하 는 것 으로 알려져 있 다 14 ) . 또한 대식세포 에서 염증 성 반응 을 연구 할 때 중요 한 자극 원 으로 사용 되 는 LPS 는 설치류 대식세포 세포 주인 RAW 264 . 7 세포 에서 TLR 4 를 통한 nuclear factor - κ B ( NF - κ B ) 신호 전달 계 를 활성 화 시키 고 IL - 6 , inducible nitric oxide synthase ( iNOS ) , COX - 2 / PGE 2 등 과 같 은 염증 성 매개물 의 발현 및 탐식 능력 을 증가 시키 는 것 으로 알려져 있 다 15 - 18 ) . 
 NO 는 혈관 내피세포 에서 분비 되 어 인접 근세포 를 자극 하 여 혈관 을 이완 시키 고 혈류 를 조절 하 는 signaling molecule 로서 혈관 계 에 작용 하 며 , 면역계 에 있 어서 는 염증 의 발현 과 해소 에 관여 하 는 면역 조절 자 로서 활성 화 된 대식세포 등 면역 세포 에 의해 생성 되 어 외부 에서 침입 한 미생물 이나 내부 에서 발생 한 종양 세포 의 사멸 에 영향 을 주 는 immune defence molecule 로서 보 고 되 어 있 다 19 ) . 
 하지만 과량 이 방출 될 경우 NO 를 생성 하 는 세포 자신 과 주위 의 정상 세포 및 조직 , 기관 에 손상 을 초래 하 며 병리 적 원인 에 의해 과도 하 게 분비 된 NO 는 혈관 투과성 , 부종 등 의 염증 반응 을 촉진 시킬 뿐 만 아니 라 염증 매개체 의 생합 성 을 촉진 하 여 염증 을 심화 시키 고 20 ) , 이 로 인해 많 은 염증 성 질환 및 만성 적 질환 을 유발 하 여 유해 한 작용 을 나타 낼 수 있 다고 보 고 되 어 있 다 21 , 22 ) . 
 PGE 2 는 NO 와 마찬가지 로 손상 된 부위 나 조직 에서 통증 과 발열 의 전달 에 주로 관여 하 는 중요 한 염증 매개 물질 로서 COX - 2 에 의해 합성 되 며 , 혈관 의 확장 과 혈관 벽 의 투과성 을 높이 고 염증 부위 로 면역 세포 들 이 모이 게 할 뿐 만 아니 라 IL - 6 와 같 은 염증 성 cytokines 의 분비 를 촉진 시킨다 . PGE 2 역시 과량 생산 되 면 과도 한 면역 반응 을 야기 하 며 다발 성 경화증 , 파킨슨병 , 알츠하이머병 , 대장암 과 같 은 각종 염증 성 질환 을 유발 시키 게 된다 . 따라서 염증 질환 의 치료 에 있 어서 NO 와 PGE 2 는 염증 과 통증 을 효과 적 으로 완화 시키 는 주요 표적 으로 유효 하 다고 알려져 있 다 23 ) . 
 IL - 6 는 처음 에 B 세포 에 성장 인자 로서 작용 하 며 immunoglobulin 의 생 성 을 유도 하 는 인자 로서 알려져 있 고 24 ) , 단핵구 나 대식세포 에서 생성 되 어 초기 의 감염 성 염증 반응 에서 발현 되 어 주변 의 면역 세포 를 활성 화 시키 며 병원균 에 대한 방어 체계 로서 작용 한다 25 ) . 또한 T 세포 에 작용 하 여 다른 염증 성 cytokines 들 의 분비 를 촉진 한다 . 이 처럼 면역 반응 전반 에 걸쳐 작용 하 여 방어 체계 로서 의 기능 을 나타내 지만 과량 분비 될 경우 류 마티스 관절염 과 같 은 자 가 면역 질환 의 발현 을 유도 하 는 등 의 병리 적 작용 을 나타낸다 26 ) . 
 MAPKs 는 p 38 , ERK 1 / 2 , JNK 1 / 2 의 3 가지 단백질 로 구성 되 어 있 으며 , 세포 의 성장 및 분화 뿐 만 아니 라 cytokines 의 생 성과 같 은 염증 성 반응 에 있 어서 도 중요 한 역할 을 수행 하 는 인산화 - 매개 기전 이 다 . LPS 등 의 자극 원 에 의해 MAPKs 가 활성 화 되 면 단백질 의 인산화 가 진행 되 며 , 염증 성 전사인자 를 활성 화 시키 고 cytokines 의 생 성 을 촉진 한다 27 ) . 
 ERK 는 MEK 와 매개 하 여 iNOS 나 COX 와 같 은 하위 의 염증 성 인자 의 발현 에 직 · 간접 적 으로 관여 한다 . 활성 화 된 ERK 는 염증 발현 의 주요 기전 으로 밝혀진 NF - κ B 의 핵 내로 의 이전 을 유발 하 여 염증 의 발현 을 조절 하 게 된다 . 이전 의 연구 에서 볼 수 있 듯이 cytokines 을 비롯 한 NO , PGE 2 와 같 은 염증 성 인자 들 의 분비 를 조절 하 기 위해 그 상위 기전 으로서 MAPKs 의 활성 화 를 억제 하 는 것 이 효과 적 임 이 알려져 있 다 28 ) . 
 이번 연구 는 전통 적 으로 감염 성 질환 에 사용 되 어 온 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 을 이용 하 여 쥐 에서 분리 한 대식세포 를 LPS 로 자극 하 여 만든 염증 모델 에 대한 HDKHS 의 항 염증 효과 를 실험 적 으로 입증 하 고 그 기전 을 확인 하 기 위해 진행 되 었 으며 , 실험 결과 LPS 로 자극 한 대식세포 를 이용 한 염증 모델 에서 NO , PGE 2 , iNOS , COX - 2 , IL - 6 와 같 은 염증 성 인자 와 관련 전사인자 의 발현 을 억제 하 였음을 확인 하 였 고 , LPS 자극 에 의해 급격히 인산화 되 었 던 ERK 1 / 2 가 HDKHS 전 처리 를 통해 억제 되 는 것 은 HDKHS 의 항 염증 활성 주요 기 전이 MAPK 의 활성 화 를 억제 함 으로서 나타나 는 것 임 을 알 수 있 다 . 
 설치류 의 대식세포 주인 RAW 264 . 7 세포 를 LPS 로 자극 하 였을 때 HDKHS 의 항 염증 효과 를 조사 하 여 다음 과 같 은 결론 을 얻 었 다 . 
 1 . HDKHS 는 대식세포 에서 LPS 자극 에 의해 증가 된 iNOS 와 COX - 2 의 발현 을 억제 한다 . 
 2 . 이 를 통해 하위 염증 성 인자 인 NO , PGE 2 , IL - 6 의 분비 를 억제 한다 . 
 3 . 또한 병원균 에 의한 자극 을 핵 내 로 전달 하 는 MAPKs 의 발현 을 억제 하 는 것 이 HDKHS 의 항 염증 활성 의 주요 기전 으로 생각 된다 . 
 이러 한 결과 로 미루 어 보 아 解毒 金 花 散 물 추출물 ( HDKHS ) 의 염증 치료 효과 가 실험 적 으로 유효 함 을 확인 하 였 고 그 기전 을 입증 하 였 다 . 
 This research was supported by Basic Science ResearchProgram through the National Research Foundation of Korea ( NRF ) funded by the Ministry of Education ( NRF - 2013 R 1 A 1 A 2064673 ) ) , by the Korea government ( MSIP ) ( 2008 - 0062484 ) . 
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