동결 보존 된 인간 단핵구 ( 스템 셀 테크 놀 로지스 ( Stem Cell Technologies ) ) 를 해동 시키 고 , 10 % FBS 를 함유 하 는 글 루타 맥스 ( GlutaMAX ) ™ ( 깁 코 ( Gibco ) ® 200 mM L - 알라 닐 - L - 글루타민 ) ( 10 mM HEPES , 1 X Pen - Strep , 55 μ M β - 메르 캅 토 에탄올 , 1 mM 피루브산 나트륨 ) RPMI 배지 에 0 . 125 X 106 개 세포 / ml 로 희석 하 고 , 37 ℃ 에서 2 시간 동안 회복 시켰 다 . 이어서 , 세포 현탁액 을 흑색 384 웰 그 라이너 투명 바닥 플레이트 상 에 5 , 000 개 세포 / 웰 의 밀도 로 플 레이팅 하 였 다 . 플레이트 에 시험 화합물 을 사전 - 스폿 팅 하 고 , DMSO 중 에 연속 희석 하 여 200 nL / 웰 을 0 . 5 % 의 최종 DMSO 농도 를 위해 에코 550 음향 액체 분배 기 ( 랩 사이트 ( Labcyte ) ®) 를 사용 하 여 전달 하 였 다 . 플 레이팅 된 세포 를 37 ℃ 에서 1 시간 동안 화합물 로 처리 하 였 다 . 이어서 비 자극 세포 대 조군 웰 을 위해 사용 된 플레이트 의 외부 칼럼 을 제외 하 고 , 세포 를 50 pg / ml 의 LPS ( 시그마 ( Sigma ) ) 로 자극 하 였 다 . 세포 를 37 ℃ 에서 추가 4 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 세포 를 배지 로부터 회전 제거 하 고 , 5 μ L 의 샘플 을 취하 고 , TR - FRET 인간 TNF α 검출 시스템 ( 시스 바이오 ( CisBio ) ) 을 사용 하 여 총 TNF α 함량 에 대해 분석 하 였 다 . 이 시스템 은 TNF α 분자 의 2 개 의 상이 한 에 피토프 에 결합 하 고 샘플 중 TNF α 의 농도 에 비례 하 게 FRET 신호 를 생성 하 는 2 개 의 표지 된 항체 ( 크 립 테이트 및 XL 665 ) 를 이용 한다 . 검출 항체 를 50 : 50 혼합 하 고 , 5 μ L 를 각각 의 웰 내 로 분배 하 였 다 . 플레이트 를 투명 한 밀봉재 로 덮 고 , 실온 에서 밤새 인 큐 베이 션 하 였 다 . 다음 날 아침 각각 340 nm / 615 nm / 665 nm 에서 의 여기 / 방출 / FRET 방출 로 엔 비전 2103 다중 표지 판독기 ( 퍼킨 엘머 ( PerkinElmer ) ) 를 사용 하 여 플레이트 를 판독 하 였 다 . 615 nm 및 665 nm 방출 파장 에서 의 형광 강도 를 비 ( 665 nm / 615 nm ) 로 표현 하 였 다 . 대 조군 퍼센트 를 하 기 와 같이 계산 하 였 다 :