RAW 264 . 7 세포 를 60 mm 세포 배양 접시 에 2 x 106 cells / dish 의 밀도 로 분주 하 고 테스트 화합물 을 처리 한 후 , TLR 작용 제 를 처리 하 였 다 . 프로테아제 ( protease ) 및 포스파타아제 억제 칵테일 ( phosphatase inhibitor cocktail , Thermo Fisher Scientific , Inc . ) 과 포유류 단백질 추출 키트 ( mammalian protein extraction kit , M - PER ; Thermo Fisher Scientific , Inc . ) 를 이용 하 여 세포 용해 물 을 수득 하 고 , 비신 코닌 산 분석 ( bicinchoninic acid assay , Sigma - Aldrich , Co . ) 을 이용 하 여 단백질 수준 을 정량 하 였 다 . 단백질 샘플 을 SDS - PAGE 로 분리 하 여 니트로셀룰로오스 막 ( GE healthcare , Inc . , Chicago , IL , USA ) 으로 옮겼 다 . 상기 막 은 phospho - JNK ( Cell Signaling Technology , Inc . , Danvers , MA , USA ) , phospho - ERK ( Santa Cruz Biotechnology , Inc . , Dallas , TX , USA ) , phospho - p 38 - MAPK ( Cell Signaling Technology , Inc . ) , phospho - p 65 ( Cell Signaling Technology , Inc . ) 또는 β - actin ( Santa Cruz Biotechnology , Inc . ) 에 대한 특이 적 1 차 항체 와 함께 배양 되 었 다 . 단백질 은 HRP - 융합 된 항 - 토끼 IgG 또는 항 - 마우스 IgG ( Thermo Fisher Scientific , Inc . ) 를 통해 탐지 되 었 다 . 단백질 수준 은 화학 발광 기질 ( chemiluminescent substrate , SuperSignal ™ West Pico PLUS , Thermo Fisher Scientific , Inc . ) 및 발광 검출 시스템 ( luminescence detection system , Fusion Solo S , VILBER , France ) 에 의해 확인 되 었 다 .