주요 생성물 A ) 단일 특이 적 < IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 , " B ) 이중 특이 적 < ANGPT 2 - IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 및 C ) < ANGPT 2 > 야생 형 항체 의 혼합물 ( "" 이중 특이 적 VL - VH / CL - CH 1 교환 혼합물 "") 을 단백질 A 아가로오스 - 비즈 ( Roche ) 로 면역 침전 에 의해 세포 배양 상청 액 ( 실시 예 3 A ) 으로부터 단리 하 였 다 . 60 ㎕ 단백질 A 아가로오스 비즈 를 TBS - NP 40 ( 50 mM 트리스 ( pH 7 . 5 ) ", 150 mM NaCl , 1 % Nonidet - P 40 ) 에서 3 회 세척 하 였 다 . 이후 , 1 ~ 15 mL 세포 배양 상청 액 을 TBS - NP 40 에서 예비 - 평형 화 된 단백질 A 아가로오스 비즈 에 적용 하 였 다 . 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 한 후 , 비즈 를 Ultrafree - MC - 필터 컬럼 ( Amicon ) 상 에서 0 . 5 mL TBS - NP 40 으로 1 회 , 0 . 5 mL 2 x 인산염 완충 생리식염수 ( 2 xPBS , Roche ) 로 2 회 , 및 0 . 5 mL 100 mM Na - 시트 레이트 ( pH 5 . 0 ) 로 간단히 4 회 세척 하 였 다 . 결합 된 항체 를 35 ㎕ NuPAGE LDS 샘플 완충액 ( Invitrogen ) 을 첨가 하 여 용리 하 였 다 . 샘플 의 절반 을 각각 NuPAGE 샘플 환원제 와 조합 하 거나 , 또는 비 환원 된 상태 로 두 고 , 70 ℃ 에서 10 분 동안 가열 하 였 다 . 그 결과 로서 , 20 ㎕ 를 4 ~ 12 % NuPAGE 비스 - 트리스 SDS - PAGE ( Invitrogen ) ( 비 환원 된 SDS - PAGE 에 대해서 는 MOPS 완충액 을 사용 하 고 , 환원 된 SDS - PAGE 에 대해서 는 NuPAGE 항산화제 영동 완충액 첨가제 ( Invitrogen ) 를 갖 는 MES 완충액 을 사용 ) 에 적용 하 고 , 쿠마시 블루 로 염색 하 였 다 . SDS - PAGE 에서 는 3 가지 항체 종류 사이 에 차이점 이 관찰 되 지 않 았 다 . 모든 항체 는 경쇄 에 상응 하 는 약 25 kDa 의 밴드 , 및 각각 의 중쇄 에 상응 하 는 50 kDa 의 밴드 를 갖 는 전형 적 인 IgG 1 항체 와 같이 거동 하 였 다 . 비 환원 된 상태 에서 는 , 완전 한 항체 에 대해 약 150 kDa 에서 밴드 를 관찰 할 수 있 었 다 . 따라서 , 기능 적 이중 특이 적 < ANGPT 2 - IGF - 1 R > VL - VH / CL - CH 1 교환 항체 의 존재 를 증명 하 기 위하 여 세 항체 종류 의 교차 혼합물 을 정제 하 고 ( 실시 예 3 C ) , 세포 FACS 가교 검정 을 설계 하 였 다 ( 실시 예 3 D ) .