상기 실시 에 1 에서 얻 어 진 티 로 시 나제 및 PMEL 과 발현 각질 형성 세포주 를 이용 하 여 인공 피부 를 제작 하 였 다 . 구체 적 으로 는 남자 8 세 포피 ( foreskin ) 로부터 분리 한 진피 세포 인 섬 유아 세포 를 5 % FBS ( Hyclone , SH 30084 . 03 ) 및 1 % 페니실린 ( Penicillin ) - 스트렙토마이신 ( Streptomycin ) ( Welgene , LS 202 - 02 ) 을 포함 하 는 DMEM ( Hyclone , SH 30243 . 01 ) 의 진피 세포 배양액 에서 37 ℃, 5 부피 % CO 2 배양 조건 으로 배양 하 여 준비 하 였 다 . 3 M 페이퍼 를 6 - 웰 플레이트 에 맞 게 링 모양 으로 재단 하 고 , 포 셉 , 추 및 링 을 멸균 하 여 준비 하 였 다 . 진피 세포 를 플레이트 에 분주 하 기 전날 , 멸균 하 여 잘 말린 3 M 페이퍼 를 6 - 웰 플레이트 에 넣 고 DPBS ( Dulbecco ' s Phosphate - Buffered Saline ) 로 적셔 주 었 다 . 3 M paper 가 6 - 웰 플레이트 의 바닥 에 고정 되 도록 추 를 올려 주 었 다 . DPBS 를 제거 한 후 , 진피 세포 를 각 웰 에 3 X 10 ^ 5 세포 로 분주 한 뒤 진피 세포 배양액 에 아스코르브산 을 100 ㎍/ ml 의 농도 로 첨가 하 여 배양 하 였 다 . 상기 진피 세포 배양액 을 2 일 에 한 번 씩 배지 를 교환 하 는 방식 으로 총 4 주 동안 37 ℃ 및 5 부피 % CO 2 배양 조건 으로 배양 하 였 다 . 배양 4 주 차 부터 는 아스코르브산 만 50 ㎍/ ml 의 농도 로 변경 하 여 배지 를 2 일 에 한 번 씩 갈아주 었 다 . 상기 진피 세포 의 배양 5 주 차 에 상기 실시 예 1 에서 제작 한 유전자 변형 된 각질 형성 세포주 와 , 무 처리 한 HaCaT 세포주 를 5 % FBS ( Hyclone , SH 30084 . 03 ) 및 1 % 페니실린 ( Penicillin ) - 스트렙토마이신 ( Streptomycin ) ( Welgene , LS 202 - 02 ) 를 포함 하 는 DMEM ( Hyclone , SH 30243 . 01 ) 의 표피 세포 배양액 에서 배양 하 였 다 . 6 주 차 에 포 셉 을 이용 하 여 6 - 웰 플레이트 로부터 진피 세포 를 조심 스럽 게 떼 어 내 서 6 cm 디쉬 ( dish ) 에 포개 어 주 는 방법 으로 3 장 쌓 아서 추로 고정 하 였 다 . 이렇게 얻 어 진 진피 세포 의 층 위 에 링 을 올린 후 , 링 안쪽 으로 준비 한 상기 실시 예 1 에서 제작 한 유전자 변형 된 각질 형성 세포주 와 , 무 처리 한 HaCaT 세포주 를 각 웰 당 2 . 5 X 10 ^ 5 세포 를 분주 하 여 상기 조성 의 표피 세포 배양액 으로 37 ℃ 및 5 부피 % CO 2 배양 조건 하 에서 배양 하 였 다 . 다음 날 링 을 제거 한 뒤 2 일 에 한 번 씩 배지 교환 하 는 방식 으로 총 6 일 동안 37 ℃ 및 5 부피 % CO 2 배양 조건 으로 배양 하 였 다 . 이렇게 얻 어 진 진피 - 표피 세포 를 A / L ( Air liquid interface ) 위 에 올려 준 후 , 5 % FBS ( Hyclone , SH 30084 . 03 ) , 1 % 페니실린 ( Penicillin ) - 스트렙토마이신 ( Streptomycin ) ( Welgene , LS 202 - 02 ) 및 0 . 6 mM CaCl 2 ( Sigma ) 를 포함 하 는 DMEM / F 12 ( GIBCO , 11320 - 033 ) 의 배지 에 세포 아랫부분 만 닿 을 정도 로 넣 어 37 ℃ 및 5 부피 % CO 2 배양 조건 으로 배양 하 였 다 . 상기 의 배양액 을 2 일 에 한 번 씩 배지 교환 하 는 방식 으로 총 2 주일 동안 37 ℃ 및 5 부피 % CO 2 배양 조건 으로 배양 하 여 인공 피부 를 제작 하 였 다 .