에 피토프 맵 핑 연구 를 위한 α Syn 펩티드 를 이노 셉 ( InnoPep ) ( 캘리포니아주 샌디에고 ) 에서 구입 하 였 다 . N - 말단 바이오틴 기 및 PEG 4 링커 및 C - 말단 을 사용 하 여 인간 α Syn 서열 의 중첩 펩티드 의 2 개 세트 를 생성 하 였 다 . 펩티드 를 PBS 중 에서 1 mg / ml 로 가용화 시켰 다 . 맵 핑 연구 를 위해 , PBS 중 0 . 25 μ g / ml α - 시뉴 클레인 펩티드 100 μ L 를 뉴트 라비딘 코팅 된 고용량 96 웰 플레이트 ( 써 모 피셔 사이언 티 픽 ) 에 첨가 하 고 , 실온 ( RT ) 에서 2 시간 동안 ( 또는 4 ℃ 에서 밤새 ( O / N ) ) 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 ~ 300 μ L 의 세 척 완충제 ( PBS 중 0 . 05 % 트윈 ) 로 3 - 회 세척 하 였 다 . 이어서 , 플레이트 를 RT 에서 ~ 2 시간 동안 ( 또는 4 ℃ 에서 O / N ) PBS 중 3 % BSA 150 μ l 로 차단 하 였 다 . 샘플 완충제 ( 0 . 1 % BSA / 0 . 05 % 트윈 / PBS , 50 ml 완충제 중 로슈 프로테아제 억제제 의 2 개 의 펠릿 ) 중 에 희석 된 시험 샘플 100 μ L 를 플레이트 상 에서 RT 에서 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 플레이트 를 3 회 세척 하 였 다 . PBSTB ( 1 % BSA / 0 . 2 % 트윈 / dPBS ) 중 에 1 : 1000 으로 희석 된 2 차 항체 100 μ L 를 첨가 하 고 , RT 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 세 척당 5 ~ 10 분 동안 3 회 세척 하 였 다 . 100 μ L 의 AP 기질 ( 트 로 픽스 CDP 스타 레디 - 투 - 유즈 위드 사파이어 II , 어 플 라이드 바이오 시스템즈 ( Applied Biosystems ) ; Cat # T - 2214 ) 을 첨가 하 고 , RT 에서 30 분 동안 발색 시켰 다 . 발광 계수 를 퍼킨 엘머 엔 비전 ( 2102 멀티 라벨 리더 ) 으로 판독 하 였 다 . 플레이트 를 검정 동안 일정 한 진탕 ( 적정 플레이트 진탕기 , 속도 3 ) 하 에 유지 시켰 다 . 사용 된 2 차 항체 는 알칼리 성 포스 파 타제 - 아 피니 퓨어 당나귀 항 - 인간 IgG ( 잭슨 이 뮤 노 # 709 - 055 - 149 ) , 알칼리 성 포스 파 타제 - 아 피니 퓨어 당나귀 항 - 토끼 IgG ( 잭슨 이 뮤 노 # 711 - 055 - 152 ) , 알칼리 성 포스 파 타제 - 아 피니 퓨어 당나귀 항 - 마우스 IgG ( 잭슨 이 뮤 노 # 715 - 055 - 151 ) 를 포함 하 였 다 . 모든 2 차 항체 를 50 % 글리세롤 최종 농도 로 희석 하 였 다 .