표적 화 된 C 에서 T 로 의 전이 를 갖 는 식물 을 수득 하 기 위해서 , 이러 한 돌연변이 를 함유 하 는 원형질체 는 성숙 한 식물 로 재생 되 어야 한다 . 이어서 , 이 들 은 재생 과정 동안 돌연변이 가 소실 되 지 않 음 을 나타내 기 위해 제노 타이핑 된다 . 토마토 원형질체 를 KG 10075 또는 KG 10252 와 조합 하 여 rAPOBEC - Cas 9 D 10 A - UGI - NLS 벡터 ( KG 10098 ) 로 트랜스펙션 시켰 다 . 대안 적 으로 , rAPOBEC 1 - Cas 9 D 10 A - UGI - NLS 단백질 을 LIN 5 sgRNA 1 과 함께 사용 하 였 다 . 이어서 , 원형질체 는 LIN 5 표적 서열 에서 C 에서 T 로 의 전이 의 존재 에 대해 제노 타이핑 될 수 있 는 캘리 를 형성 할 때 까지 성장 배지 에서 배양 되 었 다 . KG 10098 및 KG 10075 트랜스펙션 으로부터 2000 개 초과 의 캘리 가 생성 되 고 제노 타이핑 되 었 다 . 이 들 중 약 1 . 5 %( 32 캘리 ) 는 표적 서열 에서 위치 6 에서 C 에서 T 로 의 전이 에 대해 이 형 접합 성 ( heterozygous ) 인 것 으로 밝혀졌으며 , 이 는 시퀀싱 후 발견 된 이 위치 에서 의 돌연변이 빈도 ( 0 . 8 %) 와 잘 일치 한다 . 다른 6 개 의 칼리 는 위치 6 에서 C 에서 T 로 의 전이 에 대해 동형 접합 성 ( homozygous ) 인 것 으로 나타났으며 , 이 는 이 들 시약 이 이중 대립 형질 ( biallelic ) 돌연변이 를 생성 할 수 있 음 을 입증 한다 . 우리 는 rAPOBEC 1 - Cas 9 D 10 A - UGI - NLS 단백질 및 LIN 5 sgRNA 1 이 사용 된 경우 , LIN 5 표적 서열 에서 돌연변이 를 갖 는 유사 한 개수 의 캘리 를 발견 하 였 다 . 그런 다음 , 캘리 를 성숙 한 식물 로 재생 시킨 다음 에 제노 타이핑 하 였 다 ( 도 4 ) . 3 개 의 이중 대립 형질 돌연변이 를 함유 한 라인 6 을 제외 하 고 , 대부분 의 라인 은 표적 영역 에서 여러 이형 접합 성 C 에서 T 로 의 돌연변이 를 보유 하 였 다 . 각각 의 경우 에 , 캘러스 에서 발견 된 돌연변이 는 재생 된 새싹 에 존재 하 였 다 . 이 들 결과 는 표적 화 된 염기 편집 이 식물 원형질체 에서 수행 될 수 있 고 , 재생 후 돌연변이 캘 리가 ( 선택 의 적용 없이 ) 제노 타이핑 에 의해 확인 된 후 성숙 돌연변이 식물 로 재생 될 수 있 음 을 입증 한다 .