단백질 A ( HiTrap ProtA , 지이 헬 쓰 케어 ) 친화 크로마토그래피 를 이용 한 친화 크로마토그래피 로 세포 배양 상청 액 으로부터 분비 된 야생 형 또는 당 조작 된 푸 코스 결여 항체 를 정제 하 였 다 . 요약 하 건대 , 컬럼 을 20 mM 인산나트륨 및 20 mM 시트르산 나트륨 ( pH 7 . 5 ) 으로 평형 화 시키 고 , 세포 상청 액 을 적재 한 후 , 20 mM 인산나트륨 및 20 mM 시트르산 나트륨 ( pH 7 . 5 ) 을 사용 한 제 1 세 척 및 13 . 3 mM 인산나트륨 , 20 mM 시트르산 나트륨 및 500 mM 염화나트륨 ( pH 5 . 45 ) 을 사용 한 제 2 세척 을 수행 하 였 다 . 항체 를 20 mM 시트르산 나트륨 , 100 mM 염화나트륨 및 100 mM 글리신 ( pH 3 ) 으로 용출 하 였 다 . 하이 로드 수퍼 덱스 ( HiLoad Superdex ) 200 컬럼 ( 지이 헬 쓰 케어 ) 상 에서 의 후속 크기 배제 크로마토그래피 단계 에서 , 완충제 를 25 mM 인산칼륨 , 125 mM 염화나트륨 및 100 mM 글리신 용액 ( pH 6 . 7 ) , 또는 대안 적 으로 140 mM 염화나트륨 및 20 mM 히스티딘 ( pH 6 . 0 ) 으로 교체 하 고 , 순수 한 단량체 성 IgG 1 항체 를 수집 하 였 다 . 필요 한 경우 , 추가 양이온 교환 크로마토그래피 단계 를 상기 2 개 의 표준 정제 단계 사이 에 포함 시킨다 . 아미노산 서열 에 기초 하 여 계산 된 몰 흡광 계수 를 이용 하 여 280 nm 에서 광학 밀도 ( OD ) 를 측정 함 으로써 정제 된 단백질 샘플 의 단백질 농도 를 측정 한다 . 환원제 ( 5 mM 1 , 4 - 다이 티오 트레이 톨 ) 의 존재 및 부재 하 에서 의 SDS - PAGE 및 코마 시에 ( 인비 트로겐 ( Invitrogen ) 으로부터 의 심플 블루 ( SimpleBlue : 상표 ) 세이프 스테인 ( SafeStain ) ) 를 사용 한 염색 으로 항체 의 순도 및 분자량 을 분석 한다 . NuPAGE ( 등록 상표 ) 프리 - 캐스트 ( Pre - Cast ) 겔 시스템 ( 인비 트로겐 , 미국 소재 ) 을 제조자 의 설명서 에 따라 사용 한다 ( 4 % 내지 20 % 트라이스 - 글리신 겔 또는 3 % 내지 12 % 비스 - 트라이스 ) . 25 ℃ 에서 2 mM MOPS , 150 mM NaCl 및 0 . 02 % NaN 3 런닝 완충제 ( pH 7 . 3 ) 중 에서 수퍼 덱스 200 10 / 300 GL 분석 크기 - 배제 컬럼 ( 지이 헬 쓰 케 어 , 스웨덴 소재 ) 을 이용 하 여 항체 샘플 의 응 집체 함량 을 분석 한다 . 환원 된 항체 경쇄 및 중쇄 의 아미노산 주 쇄 의 무결 성 을 , 펩타이드 - N 글리 코시 다제 F ( 로슈 몰레 큘라 바이오 케미 칼스 ( Roche Molecular Biochemicals ) ) 를 사용 한 효소 처리 에 의한 N - 글리 칸 의 제거 후 나노 전기 분무 Q - TOF 질량 분광 측 정법 으로 검증 한다 .