사카로미세스 세레비 지아 에 ( Saccaromyces cerevisiae ) 를 고 - 특이 성 SpCas 9 변이체 를 단리 하 기 위한 지정 된 진화 스크린 을 개발 하 기 위한 실험 모델 로서 사용 하 였 다 . 효모 - 기반 검정 플랫 폼 을 사용 하 는 것 의 이점 은 한편 으로 는 효모 가 박테리아 와 공유 하 는 유사 성 , 예컨대 신속 한 배 가 속도 , 단일 클론 을 용이 하 게 단리 할 가능 성 및 신속 하 고 신뢰 성 있 는 형질전환 프로토콜 의 이용 가능 성 에 있 으며 ; 다른 한편 으로 는 , 효모 DNA 조직 화 및 대사 가 고등 진핵생물 세포 의 그것 과 유사 하 다는 점 에 있 다 . 따라서 , 효모 모델 은 스크리닝 결과 의 견고성 을 증가 시키 는 포유동물 시스템 과 의 유사 성 과 조합 된 고 처리 량 스크리닝 을 위한 유연 한 플랫 폼 을 제공 한다 . 처음 에 Cas 9 온 - 대 오프 - 타 겟 활성 의 동시 측정 을 위한 영양 요구 성 리포터 효모 균주 를 생성 하 기 위한 전략 을 설계 하 였 다 . 이러 한 접근 법 은 2 개 의 효모 게놈 로커스 의 변형 을 시험 하 는 것 에 있 다 : TRP 1 ( 염색체 IV ) 및 ADE 2 ( 염색체 XV ) . 델 리토 퍼 페토 ( delitto perfetto ) 접근 법 을 사용 함 으로써 , 2 개 의 로커스 의 야생 형 코딩 서열 을 TRP 1 로커스 의 경우 에 온 - 타 겟 sgRNA 를 매칭 하 는 특이 적 타 겟 서열 에 의해 또는 ADE 2 로커스 의 경우 에 상이 한 오프 - 타 겟 서열 에 의해 분리 된 2 개 의 반 으로 스플릿 하 였 다 ( 도 1 에 도식 화 됨 ) . 각각 의 오프 - 타 겟 ( ADE 2 off 1 - off 4 , 부록 표 4 ) 은 PAM 서열 로부터 증가 하 는 거리 에 위치 한 단일 미스 매치 를 함유 하 였 다 . 100 bp 복제물 을 타 겟 서열 ( TRP 1 또는 ADE 2 ) 의 양측 상 에 첨가 하 고 , 번역 의 조기 중단 을 보장 하 기 위해 정지 코돈 을 2 개 의 상동성 영역 사이 에 있 는 바 로 상류 에 위치 시켰 다 ( 도 1 ) . 리포터 카세트 삽입 에 의한 TRP 1 및 ADE 2 유전자 의 넉 아웃 은 트립토판 및 아데닌 대사 경로 에서 의 결함 을 생성 하 며 , 이 는 트립토판 의 부재 하 에서 성장 을 억제 하 고 , 세포 가 저 농도 의 아데닌 에서 정장 되 는 경우 에 아데닌 생합 성 의 중간 산물 의 세포 공포 에서 의 축적 을 초래 하 며 , 따라서 한 천 플레이트 상 의 콜로니 에 특징 적 인 적색 색소 침착 을 부여 한다 . Cas 9 에 의해 유도 된 이중 가닥 파손 의 형성 후 , 각각 의 로커스 는 2 개 의 영양소 에 대한 원영 양성 에 대한 복귀 를 얻 는 2 개 의 플 랭킹 상동성 영역 의 존재 때문 에 단일 가닥 어닐링 복구 경로 를 사용 하 여 효모 세포 에 의해 효율 적 으로 복구 될 수 있 다 . 2 개 의 로커스 의 각각 에서 의 성공 적 인 에디 팅 이벤트 는 따라서 트립토판 이 고갈 되 고 , 단지 저 농도 의 아데닌 을 함유 하 는 적절 한 리포터 플레이트 를 사용 하 여 가시 화 될 수 있 다 ( SDluta 5 , 도 1 ) . 검정 의 완전 한 판독 은 2 - 단계 프로세스 에 있 다 . 제 1 단계 는 SDluta 5 리포터 플레이트 상 에서 얻 어 진 콜로니 의 수 를 단지 형질전환 체의 총 수 에 대해 선택 하 는 경우 에 얻 어 진 것 들 ( SDlu 플레이트 ) 과 비교 함 에 의한 온 - 타 겟 절단 효율 의 평가 에 있 다 . 제 2 단계 는 온 - 대 오프 - 타 겟 활성 의 평가 를 위한 리포터 플레이트 상의 , 온 - 타 겟 절단 에 상응 하 는 적색 콜로니 ( TRP 1 +/ ADE 2 -), 및 또한 오프 - 타 겟 로커스 가 에디 팅 된 백색 콜로니 ( TRP 1 +/ ADE 2 +) 의 수 를 카 운 팅 하 는데 있 다 . 4 개 의 잠재 적 오프 - 타 겟 부위 ( ADE 2 off 1 - off 4 ) 를 함유 하 는 4 가지 효모 균주 를 생성 하 고 , yACMO - off 1 / off 4 로 명명 하 였 다 . 다음 으로 , 검정 의 판독 에 있 어서 임의 의 교란 변수 의 도입 을 회피 하 기 위해 , 상이 한 yACMO 균주 의 ADE 2 및 TRP 1 로커스 에 대한 자발 적 복귀 의 속도 를 평가 하 였 다 . TRP 1 로커스 의 복귀 는 사실 가 양성 클론 의 단리 를 초래 할 수 있 는 반면 , ADE 2 유전자 의 자발 적 재조합 은 가 음성 콜로니 를 생성 할 수 있 다 . 본 발명자 들 의 검정 동안 사용 된 실험 적 조건 에 근사 시키 기 위해 , 4 가지 균주 의 각각 을 SpCas 9 를 코딩 하 는 플라스미드 로 별개 로 형질 전환 시키 고 ; 선택 적 배지 에서 의 24 시간 인 큐 베이 션 후 , 세포 를 선택 적 플레이트 상 에 펼쳐 형질전환 체의 총 수 를 측정 하 고 , 1000 배 초과 의 세포 를 트립토판 또는 아데닌 이 고갈 된 선택 적 플레이트 상 에 플 레이팅 하 여 각각 의 로커스 에 대한 복귀 변이체 의 수 를 카 운 팅 하 였 다 . 상이 한 선택 적 조건 에서 얻 어 진 콜로니 의 수 를 비교 함 으로써 , TRP 1 및 ADE 2 로커스 둘 다 에 대한 대략 1 - 1 . 5 x 10 - 5 의 평균 복귀 빈도 를 추정 하 는 것 이 가능 하 였으며 , 이 는 따라서 무시 가능 한 자발 적 복귀 를 나타낸다 .