A 53 T - PFF 주사 30 일 후 에 병리 상태 의 평가 를 위해 마우스 를 희생 시켰 다 . 조직학 적 연구 를 위해 , 뇌 를 4 % 파라포름알데히드 ( PFA ) 중 에서 48 시간 동안 , 이어서 15 % 수크로스 중 에서 24 시간 동안 , 이어서 30 % 수크로스 용액 중 에서 48 시간 동안 ( 또는 사용 시 까지 ) 고정 시켰 다 . 슬라이딩 마이크로톰 ( 레이카 마이크로 시스템즈 ( Leica Microsystems ) , 일리노이주 버팔로 그로브 ) 상 에서 관상 , 40 μ m 연속 뇌 절편 을 제조 하 고 , IHC 분석 시 까지 동결 보호제 중 에 두 었 다 . IHC 절차 는 하 기 단계 를 포함 하 였 다 : 뇌 절편 을 염색 디쉬 로 이동 시키 고 , 포스 페이트 완충 염수 ( PBS , 써 모 피셔 사이언 티 픽 , 매사추세츠주 월섬 ) 에서 3 회 ( 5 분 / 헹굼 ) 헹구 었 다 . 이어서 , 절편 을 ( PBS 중 ) 3 . 7 % 포름알데히드 중 에서 10 분 동안 후 고정 시켰 다 . 이어서 , 이 들 을 PBS ( 10 분 / 헹굼 ) 에서 2 회 헹구 었 다 . 다음 으로 , 절편 을 30 분 동안 PBS 중 신선 한 3 % H 2 O 2 , 10 % 메탄올 중 에서 인 큐 베이 션 하 여 내인성 퍼 옥시 다제 활성 을 제거 하 였 다 . 절편 을 PBS 중 에서 3 회 헹구 고 ( 10 분 / 헹굼 ) , 이어서 실온 에서 PBS 중 의 10 % 정상 혈청 ( 2 차 항체 의 종 으로부터 의 혈청 사용 ) 플러스 0 . 3 % 트리톤 X - 100 중 에서 1 시간 차단 단계 를 수행 하 였 다 . 이어서 , 슬라이스 를 PBS ( 10 분 / 헹굼 ) 에서 3 회 헹구 었 다 . 뇌 슬라이스 를 , 부드럽 지만 균일 하 게 절편 을 교반 하 는 속도 의 마이크 로 - 타 이터 플레이트 진탕기 상 에서 4 ℃ 에서 1 차 항체 [ 항 - 알파 - syn pSer 129 ( 압 캠 , 영국 캠 브리지 ; ab 51253 ) , 1 : 100 , 000 희석 ] 중 에서 밤새 인 큐 베이 션 하 였 다 . IHC 의 제 2 일 에 , 뇌 절편 을 PBS ( 10 분 / 헹굼 ) 에서 x 4 회 헹군 후 , 비오티 닐 화 된 2 차 항체 ( PBS 중 1 : 500 염소 항 - 토끼 , 벡터 BA - 1000 ) 에서 60 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 절편 을 PBS 에서 헹구 고 ( 4 회 , 10 분 / 헹굼 ) , 후속 해서 PBS 중 에서 제조 된 ABC 복합체 에서 60 분 동안 실온 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 ( 엘리트 ABC 키트 ( Elite ABC kit ) , 벡터 래 보 러 토리 즈 ( Vector laboratories ) , 캘리포니아주 벌링게임 ) . PBS 에서 헹군 후 ( 4 회 , 10 분 / 헹굼 ) , 절편 을 퍼 옥시 다제 기질 ( 벡터 Cat . # SK - 4100 , 벡터 래 보 러 토리 즈 , 캘리포니아주 벌링게임 ) 에서 10 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 마지막 으로 , 뇌 절편 을 PBS 에서 헹구 고 ( 4 회 , 10 분 / 헹굼 ) , 슈퍼 프로스트 플러스 마이크 로 슬라이드 ( VWR , 펜 실베 니 아주 라드너 ) 상 에 마운 팅 하 였 다 . 슬라이드 를 공기 - 건조 시킨 후 , 헤마톡실린 및 스코트 의 청색 용액 에서 대조 염색 하 고 , 이어서 일련 의 에탄올 헹굼 하 였 다 . 슬라이드 를 최종 적 으로 페르 마운트 ( Permount ) 및 마이크 로 커버 유리 ( VWR , 미국 펜 실베 니 아주 라드 더 ) 를 사용 하 여 커버 슬립 하 고 , 스캐닝 및 IHC 정량화 분석 을 위해 건조 되 게 하 였 다 .