일 실시 형태 에서 , 2 개 의 gRNA , 예 를 들 어 독립 적 으로 , 단 분자 ( 또는 키메라 ) 또는 모듈 식 gRNA 는 표적 위치 의 양 편 상 에 이중 가닥 절 단부 을 위치 시키 도록 배열 된다 . 대안 적 인 실시 형태 에서 , 3 개 의 gRNA , 예 를 들 어 독립 적 으로 , 단 분자 ( 또는 키메라 ) 또는 모듈 식 gRNA 는 이중 가닥 절 단부 ( 즉 , Cas 9 뉴클레아제 와 복합체 형성 하 는 하나 의 gRNA ) 및 2 개 의 단일 가닥 단절 또는 쌍 을 이루 는 단일 가닥 단절 ( 즉 , Cas 9 니카 제 와 복합체 형성 하 는 2 개 의 gRNA ) 을 2 개 의 표적 서열 상 에 위치 시키 도록 배열 된다 ( 예 를 들 어 제 1 gRNA 는 표적 서열 의 업 스트림 ( 즉 , 5 ') 을 표적 화 하 는 데 사용 되 며 제 2 gRNA 는 삽입 부위 의 표적 서열 의 다운 스트림 ( 즉 , 3 ') 을 표적 화 하 는 데 사용 된다 ) . 또 다른 실시 형태 에서 , 4 개 의 gRNA , 예 를 들 어 독립 적 으로 , 단 분자 ( 또는 키메라 ) 또는 모듈 식 gRNA 는 삽입 부위 의 각 편 상 에 2 쌍 의 단일 가닥 단절 ( 즉 , Cas 9 니카 제 와 복합체 형성 하 는 2 개 의 gRNA 의 2 쌍 ) 을 생성 하 도록 배열 된다 ( 예 를 들 어 제 1 gRNA 는 본원 에 기재 된 표적 서열 의 업 스트림 ( 즉 , 5 ') 을 표적 화 하 는 데 사용 되 며 제 2 gRNA 는 본원 에 기재 된 표적 서열 의 다운 스트림 ( 즉 , 3 ') 을 표적 화 하 는 데 사용 된다 ) . 이중 가닥 절 단부 ( 들 ) 또는 쌍 에서 2 개 의 단일 가닥 닉 중 더 가까운 것 은 이상 적 으로 표적 위치 의 0 내지 500 bp 이내 ( 예 를 들 어 표적 위치 로부터 450 , 400 , 350 , 300 , 250 , 200 , 150 , 100 , 50 또는 25 bp 이 하 ) 에 있 을 것 이 다 . 니카 제 가 사용 될 때 , 쌍 에서 2 개 의 닉 은 서로 의 25 내지 55 bp 이내 ( 예 를 들 어 25 내지 50 , 25 내지 45 , 25 내지 40 , 25 내지 35 , 25 내지 30 , 50 내지 55 , 45 내지 55 , 40 내지 55 , 35 내지 55 , 30 내지 55 , 30 내지 50 , 35 내지 50 , 40 내지 50 , 45 내지 50 , 35 내지 45 , 또는 40 내지 45 bp 사이 ) 에 있 으며 , 서로 로부터 100 bp 이하 ( 예 를 들 어 90 , 80 , 70 , 60 , 50 , 40 , 30 , 20 또는 10 bp 이하 ) 떨어져 있 다 .