프라이머 BIOSG 104 5 '- G G T C T A G A GGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT - 3 ' ( 서열 번호 1 ) 및 BIOSG 105 5 '- G GCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC - 3 ' ( 서열 번호 2 ) 를 표준 기술 을 이용 하 여 스 트 렙 토 마이 세스 하이 그로스 코피 쿠스 NRRL 3602 ( 서열 의 기탁 번호 : AY 179507 ) 의 겔 다 나마 이 신 생합성 유전자 클러스터 로부터 카바 모일 트랜스퍼 라 제 - 암호 화 유전자 gdmN 을 증폭 시키 는 데 사용 하 였 다 . 서든 블롯 실험 을 제작자 의 교시 ( Roche ) 에 따라 비 - 방사성 핵산 표지 화 및 검출 을 위한 DIG 시약 키트 를 사용 하 여 수행 하 였 다 . DIG - 표지 된 gdmN DNA 단편 을 이종 프로브 로서 사용 하 였 다 . gdmN 생성 된 프로브 및 에이 . 프레티 오 숨 2112 으로부터 분리 된 게놈 DNA 를 사용 하 여 약 8 kb EcoRI 단편 을 서든 블롯 분석 으로 확인 하 였 다 . 단편 을 표준 절차 를 적용 하 면서 리스 무스 ( Litimus ) 28 로 클로닝 하 고 , 형질전환 체 를 콜로니 하이브리드 화 에 의해 확인 하 였 다 . 클론 p 3 을 분리 시키 고 , 약 7 . 7 kb 삽 입물 을 서열 분석 하 였 다 . 클론 p 3 으로부터 분리 된 DNA 를 EcoRI 및 EcoRI / SacI 으로 분해 시키 고 , 각각 약 7 . 7 kb 및 1 . 2 kb 의 밴드 를 분리 시켰 다 . 표지 화 반응 을 제조자 의 프로토콜 에 따라 수행 하 였 다 . 상기 명명 된 2 개 의 균주 의 코 스미드 라이브러리 를 제조자 의 교시 에 따라 벡터 SuperCos 1 및 Gigapack III XL 패 키 징 키트 ( Stratagene ) 를 사용 하 여 제조 하 였 다 . 이 들 2 개 의 라이브러리 를 표준 프로토콜 을 이용 하 여 스크리닝 하 고 , 프로브 로서 클론 p 3 으로부터 유도 된 7 . 7 kb EcoRI 단편 의 DIG - 표지 된 단편 을 사용 하 였 다 . 코 스미드 52 를 에이 . 프레티 오 숨 의 코 스미드 라이브러리 로부터 확인 하 고 , 서열 분석 기관 ( the Biochemistry Department of the University of Cambridge ) 에 서열 분석 을 의뢰 하 였 다 . 유사 하 게 , 코 스미드 43 및 코 스미드 46 을 에이 . 미 룸 의 코 스미드 라이브러리 로부터 확인 하 였 다 . 모든 3 개 의 코 스미드 는 서던 블롯 분석 에 의해 나타난 바 와 같이 , 7 . 7 kb EcoRI 단편 을 포함 한다 . 코 스미드 43 의 PKS 영역 의 약 0 . 7 kbp 단편 을 표준 프로토콜 을 적용 하 면서 프라이머 BIOSG 124 5 '- C C C G C C C G C G C GAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC - 3 ' ( 서열 번호 3 ) 및 BIOSG 125 5 '- G C G T C C T C G C G CAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC - 3 ' ( 서열 번호 4 ) 를 사용 하 여 증폭 시키 고 , 클로닝 한 후 , 겹치 는 클론 에 대해 에이 . 프레티 오 숨 코 스미드 라이브러리 를 스크리닝 하 기 위한 프로브 로서 사용 하 였 다 . 코 스미드 52 의 서열 정보 를 이용 하 여 프라이머 BIOSG 130 5 '- C C A A C C C C G C CGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG - 3 ' ( 서열 번호 5 ) 및 BIOSG 131 5 '- G T C G T C G G C TACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT - 3 ' ( 서열 번호 6 ) , 및 BIOSG 132 5 '- G T C G G T G G A C TGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC - 3 ' ( 서열 번호 7 ) 및 BIOSG 133 5 '- G G C C G G T G G T GCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG - 3 ' ( 서열 번호 8 ) ( 에이 . 프로 티오 숨 의 코 스미드 라이브러리 스크리닝 하 기 위해 사용 됨 ) 에 의해 증폭 된 DNA 단편 으로부터 유도 되 는 프로브 를 제조 하 였 다 . 코 스미드 311 및 352 를 분리 하 고 , 코 스미드 352 를 서열 분석 의뢰 하 였 다 . 코 스미드 352 는 코 스미드 52 와 약 2 . 7 kb 가 겹 칩 다 . 추가 의 코 스미드 를 스크리닝 하 기 위해 , 약 0 . 6 kb PCR 단편 을 표준 프로토콜 을 적용 하 면서 프라이머 BIOSG 136 5 '- C A C C G C T C G C G G G G GTGGCGCGGCGCACGACGTGGCTGC - 3 ' ( 서열 번호 9 ) 및 BIOSG 137 5 '- C C T C C T C G G A C A G CGCGATCAGCGCCGCGCACAGCGAG - 3 ' ( 서열 번호 10 ) 및 템 플레이트 ( template ) 로서 코 스미드 311 을 사용 하 여 증폭 시켰 다 . 에이 . 프레티 오 숨 의 코 스미드 라이브러리 를 스크리닝 하 고 , 코 스미드 410 을 분리 하 였 다 . 이 는 코 스미드 352 와 약 17 kb 가 겹치 며 , 서열 분석 을 의뢰 하 였 다 . 3 개 의 겹치 는 코 스미드 ( 코 스미드 52 , 코 스미드 352 및 코 스미드 410 ) 의 서열 을 어 셈 블링 하 였 다 . 서열 분석 된 영역 은 약 100 kbp 이 며 , 23 개 의 개방 판독 프레임 이 막베 신 생합성 유전자 클러스터 ( 서열 번호 11 ) 을 구성 하 는 것 으로 잠재 적 으로 확인 되 었 다 . 서열 번호 11 내 의 각각 의 개방 판독 프레임 의 위치 가 표 7 에 나타나 있 다 .