먼저 MCH R 1 ( 200 assays / vial ) 을 1 ㎖ 의 실험 용액 에 희석 하 여 균질 화 시킨 후 , 여과지 가 부착 된 미소 판 ( Multiwell 96 well filter plates PN 5020 , Pall Co . Ann Arbor MI , USA ) 에 8 채널 파이 펫 ( multi 8 - channel , Eppendorf , Hamburg , Germany ) 을 이용 하 여 각 웰 당 전체 부피 가 100 ㎕ 가 되게 반응물 을 분주 하 였 다 . 이때 , 비 특이 적 결합 ( non specific binding ) 대 조군 으로 는 Eu - MCH 25 ㎕, 수용체 50 ㎕ 및 MCH 25 ㎕ 를 사용 하 였으며 , 전체 결합 ( total binding ) 대 조군 으로 는 10 % DMSO 실험 용액 25 ㎕, Eu - MCH 25 ㎕ 및 수용체 50 ㎕ 을 사용 하 였 다 . 실험 군 으로 는 실시 예 에서 제조 한 화합물 25 ㎕, Eu - MCH 25 ㎕ 및 수용체 50 ㎕ 를 사용 하 였 다 . 각 시험 화합물 , Eu - MCH 및 MCH 는 반응 시 전체 부피 의 25 % 씩 을 차지 하 게 되 므로 첨가 직전 에 는 4 배 의 농도 로 준비 하 였 다 . 이후 , 15 초간 약하 게 흔들 어 주 고 상온 에서 90 분 간 반응 시켰 다 . 반응 이 끝나 면 , 부분 적 으로 수정 하 여 자체 제작 한 세척기 ( microplate washer , EMBLA , Molecular Devices ) 에 압력 을 걸 어 플레이트 를 세 척하 였 다 . 세 척 용액 으로 웰 당 300 ㎕ 씩 3 회 여과 시켜 반응 하 지 않 고 남 아 있 는 Eu - MCH 를 제거 하 였 다 . 바닥 의 물기 를 닦 아 내 고 웰 당 150 ㎕ 가 되게 해리 용액 ( DELFIA Enhancement solution , PerkinElmer , Turku , Finland ) 을 첨가 하 여 주 었 다 . 상온 에서 그대로 2 ~ 4 시간 방치 시킨 후 시차 성 형광 ( Time - resolved fluorescence , TRF ) 값 을 다 기능 형광 측정기 ( multilabel counter , Victor 2 , PerkinElmer , Turku , Finland ) 를 이용 하 여 측정 하 였으며 ( 방출 파장 : 615 nm , 여기 파장 : 340 nm ) , 하 기 수학식 에 따라 시차 성 형광 억제 율 을 계산 하 고 , 그 결과 를 in vitro 에서 MCH 를 50 % 저해 한 시험 물질 의 농도 인 IC 50 값 으로 하 기 표 3 에 표시 하 였 다 .