스테비오 시드 및 레바 우디 오시드 D 에 대한 조작 된 라운드 5 변이체 서열 번호 500 의 활성 을 서열 번호 348 과 비교 하 여 특성 화 하 기 위해 진탕 플라스크 분말 로딩 용량 반응 실험 을 수행 하 였 다 . 0 . 03 - 1 g / L 수준 의 진탕 플라스크 분말 ( SFP ) 을 1 mM 스테비오 시드 ( ChromaDex , > 94 % 순도 ) 또는 레바 우디 오시드 D ( ChromaDex , > 93 % 순도 ) 및 1 mM ADP - 글루코스 와 함께 50 mM 트리스 - HCl 완충제 , pH 7 . 5 , 3 mM MgCl 2 , 2 . 5 % v / v 에탄올 을 함유 하 는 100 μ L 의 총 반응 부피 에 첨가 하 였 다 . 반응 은 0 . 5 시간 동안 열 순환기 에서 40 ℃ 에서 수행 하 고 , 반응 을 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 50 μ L 아세 토니 트릴 로 켄 칭 하 고 , 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 상청 액 은 물 에서 1 : 67 로 희석 한 후 , 실시 예 1 , 표 1 . 1 에 기재 된 바 와 같이 LC - MS / MS 에 의해 스 테 비올 글리코시드 에 대해 분석 되 었 다 . 1 g L 로딩 에서 , 서열 번호 500 은 스테비오 시드 로부터 레바 우디 오시드 A 를 서열 번호 348 보다 1 . 2 배 초과 로 더 많이 생성 하 였 고 , 레바 우디 오시드 D 로부터 레바 우디 오시드 M 을 1 . 07 배 초과 로 더 많이 생성 하 였 다 . 이어서 , 서열 번호 499 ( 즉 , 500 ) 를 다시 클로닝 하 여 N - 말단 히스티딘 태그 를 제거 하 고 , 고 처리 량 으로 발현 시키 고 , 플레이트 를 400 μ L 에서 용해 시켰 다 . 1 mM 스테비오 시드 ( ChromaDex , > 94 % 순도 ) 또는 레바 우디 오시드 D ( ChromaDex , > 93 % 순도 ) 및 1 mM ADP - 글루코스 와 함께 50 mM 인산칼륨 완충제 , pH 7 . 3 , 3 mM MgCl 2 , 2 . 5 % v / v 에탄올 을 함유 하 는 100 μ L 의 총 반응 부피 에 2 . 5 μ L 용해 물 에 첨가 하 여 변이체 서열 번호 548 을 함유 하 는 생성 된 분말 을 변이체 서열 번호 500 변이체 에 대해 검정 하 였 다 . 반응 은 4 시간 동안 300 RPM 진탕 하 에 써 모 트론 ® 진탕 인큐베이터 에서 50 ℃ 에서 수행 하 고 , 반응 을 10 μ L 검정 물 을 0 . 2 % 포름산 을 갖 는 90 μ L 아세 토니 트릴 에 첨가 함 으로써 켄 칭 하 고 , 원심 분리 에 의해 침전 시켰 다 . 상청 액 은 물 에서 1 : 10 으로 희석 한 후 , 표 9 . 3 에서 설명 한 바 와 같이 RapidFire SPE - MS / MS 에 의해 스 테 비올 글리코시드 에 대해 분석 하 였 다 . 상기 조건 하 에서 , 서열 번호 548 변이체 는 서열 번호 500 변이체 보다 거의 1 . 5 배 더 많 은 레바 우디 오시드 A 를 스테비오 시드 로부터 생성 하 고 , 레바 우디 오시드 D 로부터 1 . 6 배 를 초과 하 는 수준 보다 더 많 은 레바 우디 오시드 M 을 생성 하 였 다 .