pET 28 : : rAPOBEC 1 - Cas 9 - UGI - NLS 발현 플라스미드 를 함유 하 는 E . coli 스트레인 BL 21 DE 3 을 카나마이신 ( 50 ㎍/ ml ) 이 보충 된 LB 배지 에서 OD 600 = 0 . 6 으로 성장 시킨 다음 , IPTG 를 최종 농도 1 mM 로 첨가 하 여 단백질 생산 을 유도 하 였 다 . 이어서 , 이 들 배 양물 을 최적 단백질 발현 을 위해 22 ℃ 에서 쉐이 커 에서 밤새 성장 시켰 다 . 이어서 , 재조합 단백질 을 제조사 프로토콜 에 따라 Ni - NTA 스핀 키트 ( Qiagen ) 를 사용 하 여 정제 하 였 다 . 이어서 , 정제 된 단백질 을 10 % 폴리아 크릴 아미드 겔 ( Invitrogen ) 상 에서 분리 한 후 쿠마시 염색 에 의해 단백질 생산 을 확인 하 였 다 . 이어서 , 정제 된 단백질 을 20 K Slide - a - Lyzer 투석 카세트 ( Thermo Scientific ) 를 사용 하 여 4 ℃ 에서 밤새 20 mM HEPES , 150 mM KCl , 1 mM DTT 및 10 % 글리세롤 로 구성 된 버퍼 ( G ) 에 대해 투석 하 였 다 . 이어서 , 단백질 을 카세트 로부터 제거 하 고 , Amicon Ultra - 4 100 K 원심 분리 필터 ( Millipore ) 에 통과 시켰 다 . 필터 상 의 단백질 을 1 x PBS 버퍼 ( NaCl , 80 g / l ; KCl , 2 g / l ; Na 2 HPO 4 , 14 . 4 g / l ; KH 2 PO 4 , 2 . 4 g / l ; pH 7 . 4 ) 으로 세척 한 다음 , 200 μ l 1 x PBS 버퍼 를 사용 하 여 필터 로부터 최종 적 으로 세척 하 였 다 . Cas 9 단백질 의 농도 를 표준 으로서 상용 Cas 9 단백질 ( M 0641 , New England Biolabs , 166 ng / ㎕) 을 사용 하 여 10 % 폴리 아크릴아미드 겔 상 에서 정량 한 다음 쿠마시 겔 염색 하 였 다 .