FRT - 기준 재조합 카세트 , 및 Red / ET - 매개 융합 용 플라스미드 및 항생제 마커 루프 아웃 을 Gene Bridges GmbH ( Germany ) 에서 수득 하 였 다 . 이 들 재료 를 사용 하 는 절차 를 Gene Bridges 프로토콜 에 따라 실행 하 였 다 . 프라이머 MCM 193 및 MCM 195 를 사용 하 여 , 제 조사 의 프로토콜 에 따라 Stratagene Herculase II Fusion 키트 를 사용 하 여 FRT - gb 2 - Cm - FRT 주형 으로부터 내성 카세트 를 증폭 하 였 다 . 5 O uL 반응물 을 하 기 와 같 은 사이클 에 적용 하 였 다 : 95 ℃, 2 분 ; ( 95 ℃, 20 초 , 55 ℃, 20 초 , 72 ℃, 1 분 ) x 5 , ( 95 ℃, 20 초 , 60 ℃, 20 초 , 72 ℃, 1 분 ) x 25 ; 72 ℃, 3 분 ; 냉각 될 때 까지 4 ℃. 제조사 의 프로토콜 에 따라 Qiagen PCR 컬 럼 으로 암 플리 콘 을 정제 하 고 , 3 O uL EB ( 용리 완충액 ) 에서 용리 하 였 다 . 1 x Roche H 완충액 및 0 . 5 uL BSA 를 갖 는 2 O uL 반응물 내 에서 NdeI 및 PciI 로 DNA 를 소화 시켰 다 . 각각 1 uL 의 NdeI , NcoI , 및 Roche H 완충액 을 함유 하 는 10 uL 반응물 내 에서 플라스미드 MCM 376 을 소화 시켰 다 . 반응 을 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 진행 시킨 후 , 절단 된 DNA 를 Qiagen PCR 컬럼 상 에서 정제 하 고 3 O uL EB 에서 용리 하 였 다 . 1 uL 벡터 , 3 uL PCR 생성물 , 1 uL Roche Quick 리가아제 완충액 2 , 5 uL 완충액 1 , 및 1 uL 리가아제 를 함유 하 는 반응물 내 에서 PCR 생성물 을 MCM 376 에 라 이게 이 션 하 였 다 . 반응 을 실온 에서 3 시간 동안 진행 시킨 후 , 제 조사 의 프로토콜 에 따라 5 uL 를 Invitrogen TOP 10 세포 에 형질 전환 하 였 다 . 형질전환 체 를 L 한천 ( LA ) 및 클로람페니콜 ( 10 ug / ㎖) 상 에서 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 선별 하 였 다 .