BLT 2 억제 에 대한 BLT 2 siRNA 억제 효과 는 노던 블 로 팅 에 의해 확인 하 였 다 . CHO - BLT 2 안정 한 세포 는 60 mm 디쉬 에서 1 x 105 cells / plate 의 밀도 로 평판 배양 하 였 다 . 24 시간 후 , 세포 를 BLT 2 특이 적 siRNA 로 순간 적 으로 트랜스펙션 시키 고 , NM _ 019839 ; 5 ' GAAGGATGTCGGTCTGCTA 3 ' 에 있 는 1705 - 1724 bp 에 올리 고 펙 타민 시약 으로 타 겟 팅 한 후 추가 24 시간 동안 10 % FBS 가 보충 된 신선 한 RPMI 1640 에서 배양 되 었 다 . 추가 배양 후 , 총 RNA 는 [ 32 P ] - dCTP 표지 된 BLT 2 프로브 로 노던 블롯 ( Northern blot ) 을 수행 하 였 다 . 스 크렘 블 ( scramble ) RNA 및 코딩 되 지 않 은 서열 BLT 2 siRNA 는 음성 대 조군 으로 사용 하 였 다 . 110 bp PCR 단편 은 다음 의 두 프라이머 를 사용 하 여 pcDNA 3 . 1 - BLT 2 클론 으로 증폭 하 였 다 , 정 방향 프라이머 : 5 ' cttctcatcgggcatcacag 3 ' 및 역방향 프라이머 : 5 ' atccttctgggcctacaggt 3 '. 이러 한 프로브 는 BLT 2 코딩 영역 에 주로 위치 하 였 다 . 총 RNA 는 TRIzol 시약 으로 추출 한 후 아가 로즈 겔 을 포함 하 는 MOPS 에서 2 시간 동안 10 마이크로그램 의 총 RNA 를 로딩 하 였 다 . 이 단계 후 , 총 RNA 를 20 x SSC 버퍼 로 밤새 Hybond N + 막 에 옮겼 다 . 상기 막 은 68 ℃ 에서 18 시간 동안 혼성 화 버퍼 에서 [ 32 P ] - dCTP 표지 된 BLT 2 프로브 로 혼상 화 하 였 다 . 그런 다음 , 68 ℃ 에서 1 시간 동안 0 . 1 x SSC ( 0 . 1 % SDS ) 에서 세척 하 고 방사능 사진 촬영 ( autoradiography ) 을 수행 하 였 다 . 도 10 은 노던 블롯 에 의해 BLT 2 발현 수준 에 대한 BLT 2 siRNA 의 억제 효과 를 나타낸다 . 상기 결과 는 BLT 2 mRNA 의 수준 이 BLt 2 siRNA ( 코딩 서열 ) 에 의해 감소 되 었 으나 , BLT 2 mRNA 의 수준 은 BLT 2 siRNA ( 코딩 되 지 않 은 서열 ) 에 의해서 는 영향 을 받 지 않 는 것 으로 나타났 다 .