세포 는 약물 처리 전 1 시간 동안 혈청 - 결핍 시켰으며 , 지시 된 농도 및 시간 동안 약물 에 노출 시켰 다 . 전체 단백질 을 준비 하 기 위해 , 세포 를 단백질 용해 버퍼 ( 50 mM Tris - HCl ( pH 7 . 4 ) , 150 mM NaCl , 5 mM EDTA , 5 mM EGTA , 5 mM 소듐 플 루오 라이드 , 2 mM 소듐 오르토 바나 데이트 , 1 % NP - 40 , 0 . 1 % 소듐 도데 실 설 페이트 [ SDS ] , 1 mM 페닐 메틸 설포닐 플 루오 라이드 [ PMSF ] , 및 단백질 억제제 칵테일 ) 에서 추출 하 였 다 . 상기 용해 물 의 단백질 농도 는 Bio - Rad dye - binding micro assay 를 사용 하 여 측정 하 였 다 . 면역 블롯 을 위해 , 20 ㎍ 의 세포 용해 물 을 SDS - 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 ( PAGE ) 으로 분리 하 였 다 . 단백질 들 을 Hybond - ECL 니트로셀룰로오스 멤 브레인 ( Amersham Biosciences , Buckinghamshire , UK ) 위 에 옮겼 다 . 상기 멤 브레인 은 0 . 1 % Tween 20 및 5 % 탈지분유 를 함유 하 는 TBS ( 10 mM Tris - HCl pH 7 . 4 , 150 mM NaCl ) 로 블로킹 하 였으며 , 블로킹 버퍼 에 희석 된 1 차 항체 ; anti - DDDDK ( ARG 62342 , arigo biolaboratories ) , 와 4 ℃ 에서 하룻밤 인 큐 베이트 하 였 다 . 상기 멤 브레인 을 세 척하 고 적절 한 2 차 항체 ; goat - anti - mouse IgG ( H + L ) ( Jackson ; 115 - 035 - 003 ) 로 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이트 하 였 다 . HRP - 컨 쥬 게이트 된 2 차 항체 를 ECL 검출 시약 을 사용 하 여 검출 하 였 다 .