균주 MCM 93 으로부터 의 플라스미드 를 제한 엔 도 뉴클레아제 NsiI 및 PstI 으로 소화 시켜 RBS 및 쿠 주 이소프렌 신 타아 제 를 함유 하 는 1724 bp 삽 입물 을 유리 시켰 다 . 1724 bp 절편 을 1 . 2 % 아가로오스 E - 겔 에서 분리 하 고 , 제 조사 의 지시 사항 에 따라 Qiagen Gel Purification 키트 를 사용 하 여 정제 하 였 다 . 플라스미드 pTrcKanKKDIy 를 제한 엔 도 뉴클레아제 PstI 으로 소화 시키 고 , 37 ℃ 에서 30 분 동안 SAP 으로 처리 하 고 , Qiagen PCR cleanup 키트 를 사용 하 여 정제 하 였 다 . 플라스미드 및 쿠 주 이소프렌 신 타아 제 를 인코딩 하 는 DNA 절편 을 Roche Quick Ligation 키트 를 사용 하 여 라 이게 이 션 하 였 다 . 라 이게 이 션 믹스 를 대장균 TOP 10 세포 에 형질 전환 하 고 , 형질전환 체 를 카나마이신 ( 50 ㎍/㎖) 함유 LA 상 에서 선별 하 면서 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 성장 시켰 다 . 올바른 형질전환 체 를 제한 소화 로 확인 하 고 , 플라스미드 를 pTrcKKDyIkISKan ( 도 24 및 25 ) 로 지정 하 였 다 . 상기 플라스미드 를 BL 21 ( λ DE 3 ) 세포 ( Invitrogen ) 에 형질 전환 하 였 다 .