Mel - ab 멜라닌 세포 를 차가운 PBS 로 세척 한 후 5 mM EDTA , 1 % SDS 가 포함 된 10 mM Tris ( pH 7 . 4 ) 로 용해 시켰 다 . 이후 세포 를 회수 한 뒤 5 X 샘플 버퍼 30 μ l 를 처리 하 고 98 ℃ 에서 10 분 간 가열 하 였 다 . phospho PKC substrate 와 phospho PKA substrate 는 12 % gel 을 사용 하 고 , 그 외 의 항체 는 7 % gel 을 사용 하 여 SDS - PAGE 로 단백질 을 분리 하 였 다 . 로딩 은 65 V 에서 20 분 ( phase 1 ) , 110 V 에서 80 분 ( phase 2 ) 을 진행 하 였 다 . 단백질 을 니트 로 셀룰로스 ( nitrocellulose ; NC ) ( MilliporeSigma , Burlington , MA , USA 또는 ATTO Technology , Amherst , NY , USA ) 멤 브레인 으로 이동 시키 기 위해 카세트 당 0 . 2 A 로 80 분 간 진행 하 였 다 . 이후 멤 브레인 을 3 % BSA 로 1 시간 동안 블로킹 ( blocking ) 하 여 비 특이 적 결합 을 방지 하 고 , 1 차 항체 를 처리 하 여 cold room 에서 밤새 반응 시켰 다 . 이후 2 차 항체 ( Rabbit , Mouse , Goat 각 1 : 5000 ) 를 처리 하 여 상온 에서 1 시간 동안 반응 시켰 다 . 사용 한 항체 는 HSP 90 ( SC - 7947 , Santa Cruz biotech , 1 : 1000 ) , Tyrosinase ( M - 19 ) ( SC - 7834 , Santa Cruz biotech , 1 : 1000 ) , TYRP 1 ( G - 17 ) ( SC - 10443 , Santa Cruz biotech , 1 : 1000 ) , DCT ( D - 18 ) ( SC - 10451 , Santa Cruz biotech , 1 : 1000 ) , MITF [ Microphthalmia ( Transcription Factor ) Ab - 1 ( C 5 ) , MS - 771 - p 1 , neomarkers , 1 : 500 ] 을 사용 하 였 다 .