" 다음 의 프로토콜 을 사용 하 여 아래 표 6 에 나타낸 바 와 같 은 "" 겉보기 "" IC 50 ( IC 50 _ APP ) 값 을 생성 하 였 다 . 특정 이론 에 결부 시키 고자 하 는 것 은 아니 지만 ", IC 50 _ APP 는 , IC 50 값 과 는 달리 , 시간 - 의존 적 억 제도 의 보다 유용 한 표시 를 제공 할 수 있 고 , 이 에 따라 결합 친화도 를 보다 더 대표 하 는 것 으로 믿 어 진다 . 프로토콜 은 다음 과 같이 HCV NS 3 / 4 A 1 b 프로테아제 효소 의 야생 형 및 C 159 S , A 156 S , A 156 T , D 168 A , D 168 V , R 155 K 돌연변이 에 대한 화합물 효능 , 순위 ( rank - order ) 및 내성 프로파일 을 평가 하 기 위해 개발 된 변형 된 FRET - 기본 분석 ( v _ 03 ) 이 다 : 바이오 엔 자 ( Mountain View , CA ) 로부터 의 NS 3 / 4 A 프로테아제 효소 의 1 OX 스톡 및 아나스 펙 ( San Jose , CA ) 으로부터 의 1 . 13 X 5 - FAM / QXLTM 520 FRET 펩타이드 기질 을 50 mM Tris - HCl , pH 7 . 5 , 5 mM DTT , 2 % CHAPS 및 20 % 글리세롤 속 에서 제조 하 였 다 . 0 . 5 ㎕ 용적 의 50 % DMSO 및 50 % DMSO 에서 제조 한 연속 희석 된 화합물 을 스포팅 한 후 , 각각 의 효소 5 ㎕ 를 코닝 ( # 3575 ) 384 - 웰 블랙 미세 역가 플레이트 ( 제조원 ; Corning , NY ) 에 가하 였 다 . 효소 를 첨가 하 고 FRET 기질 45 ㎕ 를 첨가 한 후 프로테아제 반응 이 즉시 개시 되 며 , 바이 오텍 ( Winooski , VT ) 으로부터 의 시너지 플레이트 단 독기 에서 λ ex 485 / λ em 520 에서 60 - 90 분 동안 모니터링 하 였 다 . 각 분석 의 종료 시 , 각각 의 웰 로부터 의 진행 곡선 을 선형 반응 동 력학 및 적합 도 통계 ( R 2 , 95 % 신뢰 구간 , 제곱 의 절대치 합 ) 에 대해 실험 하 였 다 . 각 반응 으로부터 의 초기 속도 ( 0 분 내지 15 + 분 ) 를 상대 적 형광 단위 대 시간 ( 분 ) 의 플롯 의 기울기 로부터 결정 한 다음 억제제 부 재시 및 효소 대 조군 부재 시의 % 로서 억제제 농도 에 대해 플롯 팅 하 여 그라 패드 소프트웨어 ( San Diego , CA ) 로부터 의 그라 패드 프리즘 에서 log [ 억제제 ] 대 반응 , 변수 기울기 모델 로부터 겉보기 IC 50 을 추정 하 였 다 .