미토콘드리아 단편 화 기 작 을 확인 하 기 위하 여 미토콘드리아 활성 과 관련 된 단백질 에서 웨스턴 블롯 ( Westernblot ) 을 수행 하 였 다 . 먼저 , 실시 예 1 에서 제조 한 S 6 K 1 유전자 녹아웃 된 세포주 를 얼음 위 에 놔두 고 50 mM 의 Tris - HCl , pH 7 . 5 , 1 % v / v 의 노니 뎃 ( Nonidet ) P - 40 , 120 mM 의 NaCl , 25 mM 의 플 루 로린 화 나트륨 ( sodium fluoride ) , 40 mM 의 β - 인산 글리세롤 ( β - glycerol phosphate ) , 0 . 1 mM 의 오르소바 나 데이트 나트륨 ( sodium orthovanadate ) , 1 mM 의 PMSF ( phenylmethylsulfonyl fluoride ) , 1 mM 의 벤즈 아미딘 ( benzamidine ) 및 2 μ M 의 마이크 로 시스틴 ( microcystin ) - LR 을 포함 하 는 용해 버퍼 로 추출 하 여 단백질 을 분리 하 였 다 . 상기 전체 단백질 을 15 , 12 및 10 % SDS - PAGE 로 로딩 한 후 , 이 모빌 론 - P 막 ( Millipore 사 ) 으로 옮겼 다 . 이 후 상기 필터 막 을 5 % 탈지유 및 0 . 2 % 트윈 ( Tween ) - 20 을 포함 하 는 1 X TBS 버퍼 ( tri - buffered saline buffer ; 140 nM NaCl , 2 . 7 mM KCl , 250 mM Tris - HCl , pH 7 . 4 ) 에서 1 시간 동안 블로킹 한 후 , 1000 배 희석 된 일차 항체 와 함께 4 ℃ 에서 밤새 배양 하 였 다 .