다양 한 사이토카인 ( IL - 2 및 IL - 15 조합 및 GM - CSF 단독 ) 으로 활성 화 된 rMSCs 에서 Fas 리간드 ( FasL ) , 퍼 포린 ( perforin ) 및 γ - INF 유전자 의 발현 레벨 을 결정 하 기 위하 여 역전사 - 중합효소 연쇄 반응 ( RT - PCR ) 기술 을 사용 하 였 다 . 활성 화 는 상기 와 같이 실시 하 였 다 . 상기 활성 화 된 rMSCs 로부터 Gibco ( Gaithersburg , MD , USA ) 에서 얻 은 TRIzol 시약 을 이용 하 여 RNA 를 분리 하 였 다 . 1 mg 의 RNA 을 DMSO ( 1 % 최종 농도 ) 의 첨가 를 제외 하 고 표준 절차 에 따라 150 ng 의 올리 고 dT 프라이머 를 사용 하 여 역전사 하 고 , 42 ℃ 에서 30 s 간 인 큐 베이 팅 하 고 , 샘플 을 95 ℃ 에서 5 분 간 가열 하 여 역전사 를 종료 하 였 다 . 다음 20 pmol 의 각 프라이머 ( FasL 를 위해 , 5 '- AGG GGC AGG TTG TTG CCA GA - 3 ' 및 5 '- CAC CCC AGT CCA CCC CCT GA - 3 ', perforin 을 위해 , 5 '- GTT GCA TCT CAC CCT CAT GGG ACC AGA CTT - 3 ' 및 5 '- TAA GCC CAC CAG CAATGT GCA TGT GTC TGT - 3 ' 및 γ - INF 를 위해 , 5 '- TCC AAC GCA AAG CAA TAC ATG - 3 ' 및 5 '- CGC TTC CCT GTT TTA GCT GC - 3 '), 2 . 5 mM MgCl 2 , 200 μ M 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스 페이트 ( DNTPs ) 및 5 % DMSO 를 포함 하 는 50 - μ l 반응 혼합물 에서 10 μ l 의 cDNA 에 대해 PCR 을 수행 하 였 다 . FasL , perforin 및 γ - INF 을 위해 사용 된 온도 조건 을 다음 과 같 다 : PCR 증폭 을 94 ℃ 에서 30 s 간 변성 , 56 ℃ 에서 30 s 간 어닐링 및 72 ℃ 에서 30 s 간 연장 의 30 사이클 로 수행 하 였 다 . 상기 PCR 산물 을 에 티 디 움 브로마이드 - 염색 된 2 % 아가로스 젤 상 에서 전기영동 에 의해 가시 화 하 였 다 . 대 조군 으로서 , β - 투 블린 ( tubulin ) 유전자 발현 을 동일 한 절차 및 그 적당 한 프라이머 , 5 '- TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACC TA - 3 ' 및 5 '- CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA AT - 3 ' 를 사용 하 여 측정 하 였 다 . 모든 프라이머 세트 는 RNA 분비 에서 DNA 오염 으로부터 의 어떤 잠재 적 신호 도 제거 하 도록 고안 하 였 다 . FasL , perforin , 및 γ - INF 유전자 의 발현 레벨 을 동일 한 방법 으로 비활성 화 된 rMSCs 에서 측정 하 였 다 .